Topic description
La famille NOX des NADPH oxydases est une famille importante de complexes enzymatiques membranaires qui interviennent, par la génération d'espèces réactives de l'oxygène (EROs), dans l'immunité innée mais aussi dans des fonctions telles que la régulation du tonus vasculaire, la synthèse hormonale, le sens de l'équilibre, etc. Les 7 isoformes humaines possèdent un composant transmembranaire homologue, NOX, contenant 2 hèmes et un FAD (NOX1 à 5 et 2 DUOX). Au-delà de cela, elles diffèrent par leur mécanisme d'activation et les sous-unités associées au composant NOX. Les NOX1 à 4 nécessitent une co-expression avec une sous-unité membranaire commune, p22phox, pour former un hétérodimère fonctionnel. Ces 4 isoformes diffèrent ensuite par les sous-unités solubles nécessaires à leur activation et par la nature des EROS produits. Grâce au développement de systèmes d'expression efficaces, spécialement conçus pour les protéines membranaires de cette famille, nous atteignons aujourd'hui un stade où l'étude structurale de ces complexes enzymatiques est désormais possible et un haut niveau de pureté est accessible. Ce nouveau système d'expression validé sur deux des quatre isoformes NOX en hétérodimère avec p22phox (co-expression), dans notre laboratoire, sera adapté à d'autres hétérodimères membranaires des isoformes NOX. Ces différentes isoformes d'hétérodimères NOX/p22phox seront insérées dans des nanodisques et assemblées avec les facteurs solubles correspondants. Après des tests de stabilité et d'activité, les complexes recombinant, aux différents états d'activation, de l'isoforme identifiée comme le meilleur candidat pour les études structurales seront utilisé pour la résolution de la structure par cryo-microscopie électronique. Ce projet nous permettra de caractériser au niveau moléculaire le processus d'activation des NADPH oxydases avec les spécificités par isoformes, ainsi que, éventuellement, les mécanismes conduisant à la production des différents ROS. Ces données structurales seront essentielles pour promouvoir une stratégie de conception de médicaments sur cette famille d'enzymes membranaires jusqu'à présent réfractaires à l'identification d'inhibiteurs spécifiques.
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The NOX family of NADPH oxidases is an important family of membrane enzyme complexes, which are involved, through the generation of reactive oxygen species (ROS), in innate immunity but also in functions such as vascular tone regulation, hormone synthesis, balance, etc. The 7 human isoforms have a homologous transmembrane component, NOX, containing 2 hemes and a FAD (NOX1 to 5 and 2 DUOX). Beyond that, they differ in their activation mechanism and the subunits associated with the NOX component. NOX1 to 4 require co-expression with a common membrane subunit, p22phox, to form a functional heterodimer. These 4 isoforms then differ in the soluble subunits required for their activation and the nature of the ROS produced. With the development of efficient expression systems, specifically designed, for membrane proteins of this family, we are reaching a stage where the structural study of these enzyme complexes is now possible and highly competitive. This new expression system validated on 2 of the four NOX isoform in heterodimer with p22phox (co-expression) in our lab, will be adapted for other membranous heterodimers (with NOX isoforms). These different NOX/p22phox heterodimer isoforms will be inserted into nanodiscs and assembled with corresponding soluble factors. After stability and activity test, the recombinant activated complex of the isoform identified as the best candidate for structural studies will be used for structure resolution by CryoEM. This project will allow us to characterize at the molecular level the activation process of NADPH oxidases with isoforms specificities, as well as, possibly the mechanisms leading to the production of different ROS. These structural data will be essential to promote drug design strategy on this family of membrane enzyme reluctant up to now to the identification of specific inhibitors.
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Début de la thèse : 01/10/
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