Étude des lipides comme régulateurs de la conformation et de l'activité des enzymes redox de l'immunité innée // studies of lipids as regulators of the conformation and activity of redox enzymes in innate immunity

Topic description

Bien que l'enzyme présente la même séquence et les mêmes cofacteurs (tels que le FAD et les hèmes), l'activité de la NADPH oxydase 2 (NOX2) varie considérablement en fonction de sa localisation dans l'organisme. Les espèces réactives de l'oxygène (ERO) sont produites en grande quantité par la NOX2 dans les cellules immunitaires innées afin de détruire les agents pathogènes, tandis que dans les cellules endothéliales ou vasculaires, son activité est plus contrôlée et contribue à la signalisation redox (par exemple, la régulation de la pression artérielle ou l'angiogenèse) .
Si les interactions protéine-protéine régissant l'assemblage des sous-unités et l'activation de la NOX2 ont été largement étudiées dans notre laboratoire et dans d'autres groupes, le rôle des lipides environnants dans la modulation de la conformation enzymatique, l'ancrage membranaire, l'assemblage du domaine cytosolique et l'activité catalytique restent peu explorés. Les lipides peuvent agir comme des régulateurs, stabilisant les états fonctionnels ou modulant la dynamique conformationnelle, mais leur contribution à la régulation de la NOX2 est mal comprise. L'étude de ce mécanisme comblerait une lacune importante dans l'enzymologie redox membranaire et présenterait un intérêt biomédical direct.
Ce projet permettra d'élucider comment des compositions lipidiques spécifiques régulent la structure et la fonction de NOX2 en étudiant NOX2 conservé dans son environnement lipidique natif ou défini, tandis que des constructions chimériques recombinantes (par exemple, Trimera) permettront d'étudier les domaines structurels essentiels à la sensibilité aux lipides. Les changements conformationnels et l'activité fonctionnelle seront analysés à l'aide d'approches biophysiques et spectroscopiques. Le dichroïsme circulaire à rayonnement synchrotron (SRCD, Synchrotron SOLEIL) permettra de surveiller la structure secondaire, la photométrie de masse (MP) et la diffusion dynamique de la lumière (DLS) permettront de vérifier la taille et la stœchiométrie des assemblages, tandis que le dichroïsme circulaire orienté (OCD, Synchrotron SOLEIL) évaluera l'orientation des hélices transmembranaires et fournira des informations sur l'assemblage du complexe enzymatique et l'ancrage membranaire. La spectroscopie UV/visible résolue en temps sera utilisé pour determiner les cinétiques de production de ROS et de la consommation des substrats (NADPH/O₂), reliant directement les états conformationnels à l'activité enzymatique. La diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS, Synchrotron SOLEIL) révélera la taille, la forme et la flexibilité globales des complexes. Les modèles structuraux générés par l'IA AlphaFold guideront l'interprétation des données expérimentales et la conception de constructions chimériques, fournissant un cadre structural pour corréler la dynamique lipide-dépendante aux résultats fonctionnels.
Ce projet devrait établir un lien mécanistique direct entre la composition lipidique, la stabilité conformationnelle, l'assemblage cytosolique et la fonction catalytique. Au-delà de l'avancement de la compréhension fondamentale du NOX2, il fournira un cadre méthodologique et conceptuel pour étudier d'autres isoformes des NOX (NOX1, 3 et 4), découvrir la régulation lipidique spécifique à chaque isoforme et éclairer les stratégies visant à moduler la production de ROS dans les maladies. Il s'agit là d'un défi majeur pour la recherche fondamentale en biologie, mais également d'un enjeu crucial pour la recherche pharmaceutique et la conception de médicaments, car les protéines membranaires restent la plus grande classe de cibles médicamenteuses.
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Despite having the same sequence and cofactors (such as FAD and hemes), the activity of NADPH oxidase 2 (NOX2) varies significantly depending on its body localisation. Reactive oxygen species (ROS) are massively produced by NOX2 in innate immune cells to destroy pathogens, while in endothelial or vascular cells, its activity is more controlled, contributing to redox signaling (e.g., blood pressure regulation or angiogenesis).
While protein–protein interactions governing subunit assembly and activation of NOX2 have been extensively studied in our laboratory and in other groups, the role of the surrounding lipid in modulating enzyme conformation, membrane anchoring, cytosolic domain assembly, and catalytic activity remains poorly explored. Lipids can act as allosteric regulators, stabilizing functional states or modulating conformational dynamics, yet their contribution to NOX2 regulation is poorly understood. Investigating this mechanism addresses a major gap in redox membrane enzymology and has direct biomedical relevance.
This project will elucidate how specific lipid compositions regulate NOX2 structure and function by studying NOX2 preserved in its native or defined-lipid environment, while recombinant chimeric constructs (e.g., Trimera) will allow probing of structural domains critical for lipid sensitivity. Conformational changes and functional activity will be analyzed using integrated biophysical and spectroscopic approaches. Synchrotron radiation circular dichroism (SRCD, Synchrotron SOLEIL) will monitor secondary structure, Mass Photometry (MP) and Dynamic Light Scattering (DLS) will monitor secondary structure and stoichiometry, while oriented circular dichroism (OCD, Synchrotron SOLEIL) will assess transmembrane helix orientation and provide insight into cytosolic domain assembly and membrane anchoring. Time-resolved UV/Visible spectroscopy will follow the kinetics of ROS production and NADPH/O₂ consumption, directly linking conformational states to enzymatic activity. Small-angle X-ray scattering (SAXS, Synchrotron SOLEIL), will reveal the overall size, shape, and flexibility of the complexes. High-confidence structural models generated by AlphaFold AI will guide the interpretation of experimental data and the design of chimeric constructs, providing a structural framework to link lipid-dependent dynamics with functional outcomes.
This project is expected to establish a direct mechanistic link between lipid composition, conformational stability, cytosolic assembly, and catalytic function. Beyond advancing fundamental understanding of NOX2, it will provide a methodological and conceptual framework to study other NOX isoforms (NOX1, 3, and 4), uncover isoform-specific lipid regulation, and inform strategies to modulate ROS production in disease. This is a major challenge for fundamental research in biology but also crucial for pharmaceutical research and drug design since membrane proteins represent the largest class of drug targets.
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Début de la thèse : 01/10/

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Contrats ED : Programme blanc GS-Chimie