Cibler le site de liaison du cholestérol de l'app pour bloquer la production d'aβ toxiques dans la maladie d'alzheimer. // targeting the app cholesterol-binding site to block toxic aβ production in alzheimer's disease.

Topic description

La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées et se caractérise par deux lésions neuropathologiques majeures : des plaques extracellulaires contenant du peptide bêta-amyloïde (Aβ) et des dégénérescences neurofibrillaires intraneuronales contenant la protéine tau hyperphosphorylée. Les thérapies actuelles contre la MA, ciblant l'amyloïde, que ce soit par la réduction de la production d'Aβ ou par l'utilisation d'anticorps, ont jusqu'à présent montré un succès limité. Nous avons précédemment démontré que des mutations au niveau du site de liaison au cholestérol de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP) (par exemple, KA, K28A de l'Aβ) dans des modèles cellulaires (HEK, neuroblastome, neurones corticaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites) orientent la production d'Aβ vers des peptides tronqués et non toxiques (par exemple, Aβ33) et empêchent la sécrétion toxique d'Aβ42/40 par les cellules porteuses de la mutation APPVI (London), responsable de la MA autosomique dominante (MAAD). Sur la base de ces résultats, notre hypothèse principale est que le ciblage du site de liaison du cholestérol de l'APP représente une nouvelle option thérapeutique pour prévenir la production d'espèces Aβ toxiques. Ce projet de doctorat vise à : 1) valider notre hypothèse in vivo à l'aide de nouveaux modèles murins porteurs de la mutation ponctuelle K28A chez les souris APP NL-G-F Knock-in (HumAPPNL-G-A-F) et chez les souris Knock-in porteuses de l'APP humanisée (HumAPPK28A), afin de prévenir la formation de plaques Aβ/amyloïdes toxiques, les biomarqueurs de la maladie d'Alzheimer et les déficits d'apprentissage et de mémoire ; 2) tester une thérapie génique par édition génique à l'aide de vecteurs viraux pour introduire in vivo la mutation K28A chez les souris HumAPPNL-G-F, dans le but de corriger l'Aβ pathologique.
L'étudiant·e établira d'abord des colonies de souris homozygotes et hétérozygotes HumAPPK28A et HumAPPNL-G-A-F, ainsi que leurs témoins. Il/Elle caractérisera leur phénotype neuropathologique et analysera les taux d'Aβ40/42/33, de Tau total, de pTau, de pTau et de NfL dans des échantillons de plasma prélevés longitudinalement (de 2 à 8 mois). À 4 et 8 mois, il/elle réalisera une caractérisation comportementale. Après sacrifice, des coupes de cerveaux semi-fixés seront soumises à un marquage immunologique avec la thioflavine et l'anticorps 4G8 pour la détection des dépôts amyloïdes, et avec l'anticorps AT8 pour la protéine Tau hyperphosphorylée. Les fractions solubles et insolubles seront préparées à partir de cerveaux semi-congelés et analysées pour la présence d'Aβ40/42/33. Un vecteur viral contenant un ARN guide ciblant K28, validé dans des cellules iPS, et le gène Cas9 sera produit dans le vecteur AAV-PHP.eB sous le contrôle du promoteur de la synapsine 1. Les souris HumAPPNL-G-F recevront une injection intraveineuse. Des souris porteuses de ce vecteur ou d'un vecteur témoin seront injectées à l'âge de deux mois, avant l'apparition de la pathologie amyloïde. Des prélèvements sanguins seront effectués mensuellement afin d'évaluer les biomarqueurs. Quatre mois après l'injection, soit à six mois, les souris seront sacrifiées et leur cerveau analysé.
Notre objectif est de démontrer que la mutation K28A oriente la production d'Aβ vers des peptides tronqués non toxiques dans un modèle murin de la MA, prévenant ainsi la production et le dépôt d'Aβ42/40 et le déclin cognitif, et offrant une nouvelle piste thérapeutique pour la MA. Tester la mutation K28A chez des souris non atteintes de MA permettra de déterminer si de courts fragments d'Aβ suffisent à un fonctionnement normal, dissociant ainsi les rôles physiologiques de l'APP et d'Aβ42/40. Enfin, l'édition du gène APP chez des souris MA pourrait inverser la formation des plaques et des lésions, et restaurer les fonctions cognitives, validant ainsi un nouveau traitement modificateur de la MA.
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Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia in the elderly population and is characterized by two prominent neuropathological lesions: extracellular amyloid-beta (Aβ) containing plaques and intraneuronal fibrillary tangles containing hyperphosphorylated tau protein. Existing AD therapies targeting amyloid, whether by reducing Aβ production or using antibodies, have shown limited success so far. We previously demonstrated that mutations in the juxta membrane Amyloid Precursor Protein (APP) cholesterol-binding site (e.g. KA, K28A of Aβ) in cellular models (HEK, neuroblastoma, hiPSC derived cortical neurons) shifts Aβ production toward truncated, non-toxic peptides (e.g., Aβ33), and prevents toxic Aβ42/40 secretion by cells carrying the APPVI (London) mutation leading to autosomal dominant AD (ADAD). Based on these results, our core hypothesis is that targeting the juxta membrane cholesterol binding site of APP is a novel therapeutic option for preventing the production of toxic Aβ species. This PhD project will 1) Validate our hypothesis in vivo using new mouse models carrying the K28A point mutation in the APP NL-G-F Knock-in mice (HumAPPNL-G-A-F) and in Knock-in mice carrying humanized APP (HumAPPK28A) to prevent toxic Aβ/amyloid plaques, AD biomarkers and learning & memory deficits; 2) Test gene editing therapy using viral constructs to introduce in vivo the K28A in HumAPPNL-G-F mice, aiming to correct pathological Aβ.
The student will first establish HumAPPK28A and HumAPPNL-G-A-F homozygous and heterozygous mouse colonies and their controls, characterize their neuropathological phenotype, analyse Aβ40/42/33, total Tau, pTau, pTau and NfL in longitudinal plasma samples (from 2 to 8 months). At 4 and 8 months she/he will perform their behavioural characterization and after sacrifice sections from half fixed brains will be immunolabelled with Thioflavin & 4G8 to detect amyloid deposits and AT8 for hyperphosphorylated Tau. Soluble and insoluble fractions will be prepared from half frozen brains and tested for Aβ40/42/33. We will produce a viral construct containing a guide RNA targeting K28 validated in iPSCs and the Cas9 in the AAV-PHP.eB vector under the Synapsin1 promoter. HumAPPNL-G-F mice will be injected i.v. with this construct or a control at 2 months of age, before the occurrence of the amyloid pathology. Blood will be collected every month, and biomarkers will be assessed. Four months after injection, at 6 months, mice will be sacrificed and their brains analysed.
We aim to show that the K28A mutation shifts Aβ production to non-toxic truncated peptides (e.g., Aβ33) in a mouse model of AD, preventing Aβ42/40 production/deposition and cognitive decline, offering a novel AD intervention. Testing K28A in non-AD mice will reveal if short Aβ fragments suffice for normal function, decoupling the physiological roles of APP and Aβ42/40. Finally, in vivo gene editing with K28A in amyloid mice may reverse plaques/synaptic damage and restore cognition, validating gene therapy as a disease-modifying AD treatment.
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Début de la thèse : 01/10/

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