Offre de thèse (h/f) biochimie et biophysique

Les mycobactéries comprennent de nombreuses espèces, notamment des agents pathogènes stricts à croissance lente tels que Mycobacterium tuberculosis (Mtb), M. leprae ou M. marinum, et des agents pathogènes opportunistes, soit à croissance lente, tels que M. avium ou M. kansaii, soit à croissance rapide, tels que M. abscessus (Mab).
Mtb est l'agent causal de la tuberculose (TB) responsable d'environ 1,6 million de décès en 2021, un chiffre en augmentation pour la première fois en dix ans, en raison de la pandémie de COVID-19. Dans le cas de Mtb non résistant, le traitement consiste en une thérpaie de deux mois à base de quatre médicaments (isoniazide, rifampicine, pyrazinamide et éthambutol), suivie d'un traitement de quatre mois à base d'isoniazide et de rifampicine. En raison de la durée du traitement et des effets secondaires, son respect strict n'est pas toujours garanti, ce qui favorise l'émergence de résistances. La proportion de tuberculose multirésistante (MDR-TB), définie comme étant résistante à la fois à l'isoniazide et à la rifampicine, chez les patients précédemment traités pour une tuberculose est de 20 %, mais peut dépasser 50 % dans certains pays. La XDR-TB est définie comme une MDR-TB qui est également résistante à au moins un médicament parmi les fluoroquinolones, la bédaquiline et le linézolide. Dans de tels cas, le traitement peut nécessiter jusqu'à 20 mois et jusqu'à sept médicaments administrés simultanément. Le taux de réussite du traitement de la MDR-TB, bien qu'en amélioration, reste inférieur à 60 %. Dans le cas de la XDS-TB, le taux de réussite peut être aussi bas que 22 %. Les médicaments utilisés en première intention pour le traitement de la TB sont anciens : le plus récent, la rifampicine, est utilisé depuis 1963. Seules trois nouvelles molécules ont été introduites en clinique pour lutter contre le Mtb au cours des 60 dernières années : la bédaquiline en 2012, le délamanide en 2014 et le prétomanide en 2019. Cependant, une résistance est déjà apparue. Il existe un réel besoin de nouveaux traitements afin de réduire l'incidence de la tuberculose.
Mycobacterium abscessus (Mab) est un pathogène opportuniste délétère couramment présent chez les patients adultes atteints de mucoviscidose et également impliqué dans les infections nosocomiales des tissus mous et de la peau. Actuellement, le traitement des infections à Mab repose sur les macrolides (azithromycine ou clarithromycine), souvent associés à divers antibiotiques (amikacine, carbapénèmes...) en fonction du profil de sensibilité de la souche. Ces traitements sont souvent inefficaces et la résistance intrinsèque et acquise de Mab à de nombreux antibiotiques a valu à cette bactérie le surnom de « cauchemar antibiotique ». Comme pour toutes les mycobactéries, cette résistance intrinsèque est en partie attribuée à l'enveloppe cellulaire contenant de l'acide mycolique. Dans le cas de Mab, cette résistance intrinsèque est exacerbée par la présence de multiples enzymes modifiant les antibiotiques et leurs cibles. En conséquence, les médicaments actifs sur Mtb sont pour la plupart inefficaces dans le cas de Mab. De plus, le pipeline de découverte de médicaments est peu fourni et la plupart des composés actuellement étudiés sont en fait des composés réutilisés ou des reformulations de médicaments existants. Plus encore que dans le cas de Mtb, de nouveaux médicaments sont nécessaires de toute urgence pour faire face à l'incidence accrue des infections à Mab chez les patients fragiles (immunodéprimés, atteints de mucoviscidose) ainsi que dans la population générale.

Mab et Mtb ont en commun des enzymes essentielles appartenant au système FAS-II nécessaires à la biosynthèse des acides mycoliques, qui constituent des cibles privilégiées pour la découverte de nouveaux médicaments antituberculeux. Parmi ces enzymes essentielles, InhA catalyse la réduction des substrats trans-2-énoyl-ACP et est la cible principale du médicament antituberculeux de première ligne INH. L'INH agit comme un promédicament nécessitant une activation par la catalase-peroxydase KatG. Les mutations du gène katG et de la région promotrice du gène inhA sont les principales causes de la résistance à l'INH. Différentes classes d'inhibiteurs directs de Mtb-InhA, ne nécessitant aucune activation préalable par KatG, ont été découvertes, notamment (par ordre alphabétique) : les benzothiophènes, les diazaborines, les pyridomycines, les pyridones (notamment le composé principal 4-hydroxy-2-pyridone NITD-916), les pyrrolidine carboxamides, les thiadiazoles et les dérivés du triclosan (TCL). Cependant, aucun de ces composés n'a encore été approuvé pour une utilisation clinique. Des méthodes de découverte de médicaments basées sur des fragments ont également été utilisées et ont conduit à la découverte d'un inhibiteur nanomolaire de Mtb-InhA, mais malheureusement sans aucune activité contre Mtb. Il est donc actuellement nécessaire d'identifier de nouveaux inhibiteurs actifs sur les agents pathogènes.

Les phosphopantéthéinyltransférases (PPTases) catalysent le transfert du groupe 4'-phosphopantéthéinyle (Ppant) du coenzyme A (CoA) vers un résidu sérine conservé du domaine acyl carrier (CP) des synthases d'acides gras (FAS), des polykétide synthases (PKS) et des synthases de peptides non ribosomaux (NRPS). Ces mégasynthases, qui peuvent exister sous forme de grands polypeptides multidomaines (type I) ou d'un assemblage de protéines distinctes (type II), sont responsables de la biosynthèse d'une large gamme de lipides et de composés organiques complexes. Le transfert du Ppant vers le domaine CP permet au substrat d'être fixé par une liaison thioester et acheminé vers les différents sites catalytiques des synthases. Il s'agit d'une étape d'activation obligatoire pour toutes les FAS, PKS et NRPS. Les PPTases sont classées en trois familles : les PPTases de la famille I, généralement appelées AcpS, activent principalement les systèmes FAS-I, tandis que celles de la famille II activent les voies de biosynthèse des métabolites secondaires et les FAS-II. Les PPTases de la famille III sont en fait des domaines des mégasynthases FAS-I des levures et des champignons.

Dans Mtb, deux gènes codant des FAS et près de vingt gènes codant des PKS ont été identifiés. Ils sont impliqués dans la synthèse des acides mycoliques et de nombreux autres composés lipidiques présents dans l'enveloppe cellulaire des mycobactéries, tels que les sulfolipides, les di- et polyacyl-tréhaloses, les phénolglycolipides. Outre leur rôle important dans la structuration de l'enveloppe cellulaire, bon nombre de ces composés, tels que les acides mycoliques, le dimycolate de tréhalose et le dimycocérosate de phthiocérol, se sont avérés essentiels à la pathogénicité de Mtb. D'autre part, Mab contient 2 systèmes FAS et au moins 15 gènes codant pour des PKS ou des NRPS. Certains de ces gènes sont impliqués dans la biosynthèse des acides mycoliques ou des lipides de l'enveloppe cellulaire présents dans une grande variété d'espèces de mycobactéries non tuberculeuses, tels que les glycopeptidolipides, les polyphléates de tréhalose ou les lipooligosaccharides. Le génome de Mtb code deux PPTases, l'une dédiée au système FAS-I (AcpS), tandis que l'autre est responsable de l'activation de FAS-II et de tous les PKS et NRPS (PptT). Ainsi, PptT joue un rôle essentiel dans la biosynthèse des principaux composants de la paroi cellulaire et des facteurs de virulence lipidiques chez Mtb. Nos collaborateurs de l'IPBS ont en effet démontré le caractère essentiel de la PptT pour la croissance bactérienne in vitro et pour la croissance et la persistance dans le modèle murin. Cette hypothèse a été confirmée par la découverte du composé amido-urée 8918, un inhibiteur de croissance de Mtb, dont il a été démontré qu'il exerçait son effet bactéricide en se liant à la PptT.
Le génome de Mab code également deux PPTases, PptAb étant orthologue de PptT. PptT et PptAb partagent 69 % d'identité de séquence. Ces enzymes sont donc susceptibles d'avoir un rôle très similaire dans la biosynthèse des composants essentiels de l'enveloppe cellulaire et de multiples facteurs de virulence. Alors que PptT s'est avérée essentielle à la croissance de Mtb in vitro et nécessaire à sa multiplication et à sa persistance dans le modèle d'infection chez la souris, PptAb s'est révélée nécessaire à la croissance in vitro de Mab. Des mutations dans le gène MAB_3570c, qui code pour PptAb, ont en effet entraîné des défauts de croissance. PptT et PptAb sont donc des cibles thérapeutiques potentielles.

PROJET DE THESE
En étroite collaboration avec deux gropues de chimistes du laboratoire SPCMIB, nous avons mis en place deux projets de recherche financés par l'ANR visant à concevoir et caractériser des inhibiteurs de d'InhA et des PPTases de Mtb et Mab.
Dans le cas des PPTases, de nombreuses données structurales ont été générées par un criblage cristallographique d'une bibliothèque de fragments : plus de 70 structures de PptAb liées à des fragments ont été obtenues. Sur la base de ces connaissances, un doctorant co-encadré par Y. Genisson et L. Maveyraud concevra et synthétisera l'évolution de ces fragments, dans le but d'obtenir des inhibiteurs puissants des PPTases.
Dans le cas de l'InhA, en collaboration avec notre groupe, le groupe de C. Lherbet a mis en place des approches synthétiques originales afin d'explorer d'éventuels sites de liaison inexploités dans le site actif, appelés « portails mineurs ». Un doctorant co-encadré par C. Lherbet et L. Mourey a utilisé l'approche de synthèse cinétique guidée par la cible (KTGS) pour générer de nouveaux composés ayant une activité inhibitrice potentielle. Dans cette approche, un mélange de fragments réactifs est incubé en présence de la protéine, dans le but que le site de liaison de la protéine sélectionne la liaison de fragments spécifiques, entraînant ainsi des réactions spécifiques.

Dans les deux projets, l'évolution et la sélection des fragments s'appuient sur les informations fournies par la biologie structurale et la biophysique. Ce projet doctoral vise à fournir ces informations afin de guider la synthèse chimique et l'optimisation.
Plus précisément, le doctorant sélectionné devra optimiser l'expression et la purification des protéines afin de fournir des protéines pures pour les expériences cristallographiques et biophysiques.
Le doctorant sera également responsable de la partie biologie structurale du projet : obtention de cristaux de complexes protéine-ligand, collecte de données au synchrotron, détermination et affinement de la structure. Il/elle participera également à l'interprétation des informations structurales afin de guider la synthèse chimique.
La dernière partie du projet consistera à caractériser l'interaction protéine-ligand à l'aide des technologies biophysiques disponibles à l'IPBS (décalage spectral, TRIC, ITC...) et à déterminer les propriétés inhibitrices des composés synthétisés par rapport aux protéines d'intérêt.



Contexte de travail

La personne recrutée rejoindra le Groupe de Biophysique Structurale, dirigé par Lionel Mourey, au sein de l’Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS, UMR 5089) à Toulouse. Les 17 équipes de l'IPBS sont à la pointe de la découverte, de la caractérisation et de l'exploitation de nouvelles voies et cibles pharmacologiques dans les domaines du cancer, des maladies infectieuses et des troubles inflammatoires, grâce à l'utilisation d'approches de biologie moléculaire et cellulaire, ainsi que d'expériences in vivo, y compris des études sur les maladies infectieuses basées sur le BSL-3.
L'activité du groupe de Biophysique Structurale va de la recherche fondamentale à la recherche appliquée dans les domaines de la biologie structurale, de la biophysique et du criblage. Notre expertise couvre toutes les étapes de l'ingénierie à la caractérisation biochimique, biophysique et structurale d'assemblages macromoléculaires complexes et de complexes macromolécule-ligand présentant un grand intérêt pour la recherche pharmaceutique et biotechnologique.
Le projet est financé par l’ANR et est mené dans le cadre d’une collaboration instaurée de longue date avec les équipe de Y. Génisson et de C. Lherbet au SPCMIB La direction de la thèse sera assurée conjointement par Laurent Maveyraud et Virginie Nahoum.

PROFIL SOUHAITE
Titulaire d'un Master en biologie structurale, biophysique ou biochimie des protéines avec des connaissances dans au moins 2 des 3 domaines suivants :
- Biochimie des protéines et méthodes de purification
- Méthodes biophysiques pour la caractérisation des interactions protéine-ligand
- Cristallographie aux rayons X
Expérience pratique souhaitée :
- Expression et purification de protéines recombinantes dans E. coli
- Caractérisation des protéines (DLS, DSF) et/ou des interactions protéine-ligand (DSF, nanoDSF, thermophorèse, décalage spectral, etc.)
- Cristallisation de protéines
- Détermination de la structure des macromolécules par cristallographie aux rayons X
Langue :
Niveau expérimenté (minimum C1) en anglais et/ou en français.