Etude par rmn de la machine moleculaire clpx/p en action // nmr investigations of proteolytic clpp/clpx molecular machine in action

Topic description

L'ATPase ClpX est un complexe protéique hexamérique en forme d'anneau de kDa qui fonctionne comme un moteur macromoléculaire sophistiqué, entraînant divers processus cellulaires dépendants de l'ATP. ClpX subit des changements conformationnels à grande échelle qui conduisent à la conversion de l'énergie chimique de l'ATP en travail mécanique afin d'accomplir un large éventail de fonctions, telles que le dépliement et la translocation du substrat protéique à l'intérieur d'une chambre de protéolyse de la protéase associée ClpP. Les complexes ClpP sont de grandes protéases à sérines cylindriques formées par deux anneaux heptamériques empilés tête-bêche, d'un poids moléculaire total d'environ kDa. Les anneaux hexamériques de ClpX sont capables de se lier des deux côtés du 14-mère ClpP, formant une machine protéolytique de 26 sous-unités d'environ kDa.
Malgré des études biochimiques approfondies sur ces assemblages macromoléculaires, le mécanisme de dépliement et de dégradation des substrats est resté longtemps méconnu. En effet, jusqu'à récemment, la caractérisation structurelle des complexes protéases ClpX/P était entravée par la taille et la complexité du mécanisme, qui abrite plusieurs sous-unités protéiques agissant ensemble pour traiter les protéines à dégrader. De plus, les principaux réarrangements structuraux impliqués dans le mécanisme de ce complexe représentent un défi pour la biologie structurale. Au cours des dernières années, les progrès de la cryo-microscopie électronique ont permis de déterminer les premières structures de la machine ClpP/X (1-3). Si les techniques de cryo-microscopie électronique et de cristallographie aux rayons X permettent de déterminer la structure de ces grands complexes protéiques, ces méthodes de biologie structurale ne fournissent qu'une image statique du système et ne fournissent que rarement les données cinétiques nécessaires à une compréhension complète du mode d'action à une résolution atomique. Une multitude de questions fondamentales sur le mécanisme ClpP/X restent sans réponse, telles que : Quelle est la base structurale de la reconnaissance ClpX/protéine client ? Comment les anneaux ClpX et ClpP se reconnaissent-ils malgré leur asymétrie ? Quelle est la dynamique de liaison et de libération des sous-unités ClpP/X lorsque la machine est alimentée par l'ATP ? Quels sont les mécanismes par lesquels les protéines clientes sont dépliées et transférées à travers les pores ClpX et ClpP ? Quelles sont les différentes étapes du dépliement, du transfert et de la dégradation des protéines clientes par la machine ClpP/X active ? Quelles sont les cinétiques de chaque étape et les structures des différents intermédiaires du cycle fonctionnel de ClpP/X ?

L'objectif de ce projet de doctorat est de comprendre le mécanisme de la machine ClpP/X, en obtenant par RMN en solution des informations structurales et cinétiques détaillées sur les mécanismes de ces machines protéolytiques alimentées par l'ATP dans des conditions fonctionnelles.
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ClpX ATPase is a ring-shaped hexameric protein complexes of kDa that operate as elaborate macromolecular motors, driving a variety of ATP-dependent cellular processes. ClpX undergoes large-scale conformational changes that lead to the conversion of chemical energy from ATP into mechanical work to perform a wide range of functions, such as unfolding and translocation of the protein substrate inside a proteolysis chamber of the ClpP associated protease. ClpPs are large cylindrical serine proteases formed by two head-to-head stacked heptameric rings with a total molecular weight of ca. kDa. Hexameric rings of ClpX are able to bind on both side of ClpP 14 mer, forming a 26 subunits proteolytic machine of ca. kDa.
Despite extensive biochemical studies on these macromolecular assemblies, the mechanism of substrate unfolding and degradation has long remained elusive. Indeed, until recently, structural characterization of ClpX/P protease complexes remained hampered by the size and complexity of the machinery, harboring multiple protein subunits acting together to process proteins to be degraded. Additionally, the major structural rearrangements involved in the mechanism of this complex represent a crucial challenge for structural biology. During the last years, advances in cryo electron microscopy have enabled the determination of the first structures of ClpP/X machine (1-3). While cryoEM and X-ray crystallography technics enable the structure determination of such large protein complexes, these structural biology methods provide only a static picture of the system and rarely report the kinetic data necessary for a full understanding of the mode of action at an atomic resolution. A myriad of fundamental questions on ClpP/X mechanism remains unanswered such as: What is the structural basis for ClpX/client recognition? How ClpX and ClpP rings recognize each other despite the symmetry mismatch? What is the dynamics of ClpP/X subunit binding and release, when the machine is fueled by ATP? What are the mechanisms by which client proteins are unfolded and transferred through ClpX and ClpP pores? What are the different steps of client protein unfolding, transfer, degradation by the active ClpP/X machine? What are the kinetics for each step and structures of different intermediates of ClpP/X functional cycle?

The objective of this PhD project is to understand the mechanism of the ClpP/X machine, by obtaining, using solution-state NMR, detailed structural insights and kinetic information on the mechanisms of these ATP-fueled proteolytic machinery under functional conditions.
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Début de la thèse : 01/10/

Funding category

Public funding alone (i.e. government, region, European, international organization research grant)

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Concours pour contrat doctoral