Conception assistée par l'ia et validation biophysique de protéines chimériques mimant les complexes producteurs de ros de l'immunité innée // ai-assisted design and biophysical validation of chimeric proteins mimicking the ros-producing complexes of inna

Topic description

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont responsables de la destruction des pathogènes, un processus au cœur de l'immunité innée. Leur production est spécifiquement médiée par la NADPH oxydase (NOX), une enzyme redox multimérique liée à la membrane de globules blancs. L'assemblage et la fonction de la NOX dépendent de différents paramètres et partenaires. Pour être fonctionnelle, cette enzyme membranaire nécessite l'assemblage d'au moins 6 protéines, dont certaines sont modulaires et possèdent des régions intrinsèquement désordonnées. Leur dysfonctionnement conduisant à des pathologies sévères (maladies immunitaires et neurodégénératives), elles sont considérées comme une cible thérapeutique potentielle (Cipriano et al., J Med Chem ). Les connaissances structurales des complexes sont entravées par leur nature membranaire, leur multimérisation transitoire, leurs régions désordonnées, leur sensibilité à la purification en présence de détergent. Nous avons récemment utilisé AlphaFold2 combiné à des simulations de dynamique moléculaire pour dévoiler une partie de l'assemblage membranaire de la NADPH oxydase (Aimeur et al. BioRiv ; Aimeur, JBC ), apportant une grande confiance dans la prédiction in silico de tels assemblages complexes de protéines membranaires. Cela ouvre la voie à la conception rationnelle de constructions chimériques qui imitent l'architecture et la fonction des complexes produisant des ROS. Le développement de systèmes chimériques qui ne sont pas présents dans la nature facilite les études structurales et fonctionnelles mais aussi la biosynthèse de « smart » médicaments.
Des gènes artificiels seront donc créés pour produire ces complexes chimériques de protéines membranaires, basés sur des motifs structurels des enzymes NOX et des sous-unités associées, avec une grande fidélité structurelle au complexe NOX natif qui peut prendre en charge la production de ROS. Les constructions seront conçues pour être exprimées sous une forme soluble ou compatible avec les nanodisques afin d'être capable de produire des ROS. La confirmation du repliement protéique correct et de la stœchiométrie sera effectuée par chromatographie, dichroïsme circulaire (CD), diffusion dynamique de la lumière (DLS) et photométrie de masse (MP). La résonance plasmonique de surface (SPR) et l'interférométrie bicouche (BLI) seront utilisées pour suivre la dynamique des assemblages. La production de ROS et l'investigation d'inhibiteurs seront réalisées à l'aide de spectroscopies résolues en temps (absorption/fluorescence). L'architecture de ces nouvelles protéines seront combinées avec les données de prédiction de structure AlphaFold.
Cela fournira des informations cruciales sur les mécanismes moléculaires qui régissent le fonctionnement du complexe enzymatique. Ces données permettront d'aborder des questions physiologiques clés concernant sa régulation. Ces travaux démontreront une stratégie généralisable pour valider les prédictions AlphaFold pour les systèmes membranaires complexes. Ils soutiendront également le développement d'effecteurs immunitaires synthétiques à usage antimicrobien ou thérapeutique et exploreront des systèmes pathogènes mimétiques afin d'étudier la reconstitution dynamique du complexe.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Reactive oxygen species (ROS) are responsible for the destruction of pathogens, a process at the core of innate immunity. Their production is specifically mediated by the NADPH oxidase (NOX), a membrane-bound multimeric redox enzyme, present in white blood cells. The assembly and function of NOX depend on different parameters and partners. To be functional, this membrane enzyme requires the assembly of at least 6 proteins, some of which are modular and possess intrinsically disordered regions. As their dysfunction leads to severe pathologies (immune and neurodegenerative diseases (Stasia and Roos, ), they are considered a potential therapeutic target (Cipriano et al., J Med Chem ). Understanding the structural dynamics of these complexes has been hampered by their membrane-embedded nature, transient multimerization, disordered regions, sensitivity to purification, and detergent conditions. We recently used AlphaFold2 combined with molecular dynamics simulations to unveil part of the membrane assembly of NADPH oxidase (Aimeur et al. BioRiv ; Aimeur, JBC ), allowing high confidence in the in silico prediction of the membrane protein assemblies. In particular, this opens the door to rationally designing chimeric constructs that mimic the architecture and function of native ROS-producing complexes. The development of chimeric systems that are not present in nature enables easier structural and functional studies, but also smart drug biosynthesis. Therefore, artificial genes will be created to produce these chimeric membrane protein complexes, based on structural motifs from NOX enzymes and associated subunits, with high structural fidelity to the native NOX complex that can support ROS production. The constructs will be engineered for expression in a soluble or nanodisc-compatible form and with ROS production possibilities. Experimental confirmation of correct folding and stoichiometry will be performed by chromatography, Circular Dichroism (CD), Dynamic Light Scattering (DLS), and Mass Photometry (MP). Surface Plasmon Resonance (SPR) and Bilayer Interferometry (BLI) will be used to follow the dynamics of assemblies. ROS-generating function and inhibitory investigation will be performed using mastered time-resolved (absorption/fluorescence) spectroscopies. The resulting architectures will be combined with AlphaFold structure prediction data.
This will provide crucial information on the molecular mechanisms that govern the functioning of the enzyme complex. These data will make possible to address key physiological questions concerning its regulation. This work will demonstrate a generalizable strategy to validate AlphaFold predictions for complex membrane redox enzymes. It will also support the development of synthetic immune effectors for antimicrobial or therapeutic use and explore pathogen-mimetic systems to study the dynamic reconstitution of the complex
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Début de la thèse : 01/01/

Funding category

Funding further details

PhD call Stand up for Science UPSaclay