Novel chemical tools to study the role of mitochondrial superoxide in cancer cell death. (thèse internationale)
La génération de radicaux libres dans les systèmes biologiques a été découverte il y a environ 60 ans. Les radicaux sont des espèces chimiques avec un électron non apparié résultant en une réactivité élevée et donc une courte durée de vie. Les radicaux cellulaires sont impliqués dans les processus physiologiques régulant la signalisation redox ou la défense immunitaire. Une production accrue de radicaux libres peut toutefois entraîner des dommages structurels aux biomolécules, entraînant une peroxydation lipidique, une modification post-traductionnelle des protéines et des dommages à l’ADN. Parmi les radicaux biologiques, l’anion radical superoxyde (O2•–) est la principale espèce radicalaire qui peut initier la cascade des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Il existe plusieurs voies reconnues de production cellulaire d’O2•-, à la fois enzymatiques (par exemple, à partir des protéines mitochondriales OXPHOS, NADPH oxydases) et non enzymatiques (par exemple, rayonnement, photochimie, xénobiotiques).
L’augmentation de la production d’O2•- mitochondrial a été impliquée dans de nombreuses maladies, notamment la neurodégénérescence, les maladies cardiovasculaires et le cancer. Cependant, dans la plupart des cas, il est expérimentalement difficile de définir le rôle réel du O2•–. L’incapacité à détecter sélectivement le O2•– ou à moduler sa production sont des facteurs limitants évidents. En fait, pour la plupart des pathologies, les mécanismes impliqués et le rôle des ROS ne sont pas entièrement compris. L’écart entre de nombreux rapports sur le rôle des ROS dans un trouble spécifique peut être attribué à des différences dans : (i) l’espèce détectée (identité) ; (ii) la quantité (niveau), et (iii) la localisation de la production de ROS au niveau subcellulaire (localisation). En raison de la nature transitoire des ROS, la prise en compte de ces trois variables n’est pas triviale et nécessite le développement de nouveaux outils pour la détection, l’identification et les analyses quantitatives rigoureuses des ROS au niveau subcellulaire. Malgré les progrès réalisés dans la compréhension de la biologie chimique des ROS et les efforts considérables consacrés au développement de sondes pour les ROS, la détection et la quantification fiables de l’O2•– restent un défi.
Objectifs : Il existe plusieurs obstacles scientifiques et techniques à la détection du O2•– subcellulaire. La détection et la quantification de l’O2•– mitochondrial restent une énigme importante en biologie redox qui entrave les progrès dans notre compréhension de la biologie redox mitochondriale. De nouveaux outils pour la modulation de la production mitochondriale d’O2•– et pour la détection spécifique de l’O2•– au niveau subcellulaire sont désespérément nécessaires pour comprendre son rôle dans la prolifération des cellules cancéreuses et pour le développement de nouvelles stratégies anticancéreuses basées sur l’oxydoréduction.3 La détection rigoureuse du superoxyde nécessite l’utilisation de sondes qui produisent des produits marqueurs spécifiques formés uniquement en présence de superoxyde.4 5 Il s’agit notamment des pièges à spin azoté cycliques (par exemple, DIPPMPO) et de la sonde fluorogénique à hydroéthidine (HE). Les laboratoires des Drs Hardy et Zielonka ont participé au développement et à la caractérisation de sondes ciblant les mitochondries, y compris les pièges de spin ciblant les mitochondries, comme en témoignent de nombreuses publications conjointes. Ce projet de thèse de doctorat bénéficiera également de l’expérience acquise par les deux laboratoires lors d’études antérieures sur le développement de nouveaux agents ciblant les mitochondries, afin de délimiter le rôle de l’O2•– mitochondrial dans la prolifération des cellules cancéreuses et les thérapies anticancéreuses.6-8
Cette thèse proposée vise à développer de nouveaux outils de biologie chimique pour détecter le superoxyde mitochondrial dans les systèmes acellulaires et acellulaires. Les sondes chimiques développées seront appliquées à l’étude du rôle du superoxyde mitochondrial dans la prolifération des cellules cancéreuses et dans les stratégies anticancéreuses
Méthodologie
- Objectif 1. Préparation de nanoparticules et de précurseurs de nanoparticules ciblant les mitochondries
L’objectif 1 de la thèse portera sur la synthèse de nanoparticules de silice mésoporeuses hybrides bis-fonctionnalisées biologiquement compatibles permettant le greffage des sondes (objectifs 2 et 3) en connaissant l’accessibilité à la porosité. Les MSN ont déjà été utilisés comme nanotransporteurs pour l’administration de médicaments mitochondriaux, mais peu d’études ont proposé leur utilisation pour la détection des ROS. La fraction cationique du triphénylphosphonium (TPP) est l’un des groupes de ciblage les plus adaptables utilisés pour conjuguer une molécule d’intérêt aux cations lipophiles afin de cibler la molécule/la particule vers les mitochondries.10 L’objectif 1 impliquera la préparation et la caractérisation rigoureuse des MSN avec les pièges à spin et les sondes redox greffées à l’intérieur et les MSN ciblant les mitochondries décorées de mitochondries ciblant les fractions TPP à l’extérieur, à utiliser dans les objectifs 2 à 4 de ce projet.
Objectif 2. Développer le Nano-SpinTrap et la technique Nano-BOOST
L’objectif 2 impliquera la préparation de nanoparticules ciblant les mitochondries où le piège à spin est ancré à l’intérieur des pores de la silice (Fig. 2) et l’évaluation de ses performances par spectrométrie EPR dans des cellules stimulées pour produire de l’O2•–. Ensuite, la technique Nano-BOOST sera développée, afin d’étendre l’applicabilité du test BOOST (oxydation-piégeage de spin au bore) aux cellules intactes et perméabilisées et aux mitochondries isolées. L’une des limites du test BOOST est la réduction de l’adduit O2•– (DIPPMPO-OOH) en adduit •OH (DIPPMPO-OH) par le GSH avant sa réaction avec la sonde de bore. Un piège à nano-spin (préparé dans l’objectif 1) sera utilisé pour stabiliser le DIPPMPO-OOH. La combinaison du piège à nano-spin avec les sondes au boronate permettra d’étendre la technique BOOST aux cellules intactes, où la réduction de DIPPMPO-OOH « libre » en DIPPMPO-OH limite l’utilité de la technique. La combinaison des pièges à spin liés aux particules avec des sondes au boronate pour la détection de l’O2•– offrira une opportunité passionnante de surveiller sélectivement l’O2•– cellulaire à l’aide de la détection basée sur la fluorescence.
Objectif 3. Développer un kit Superoxyde
L’objectif 3 se concentrera sur la modification de la structure chimique des sondes à base d’éthidium pour l’O2•–. L’intégration des sondes dans des nanoparticules biologiquement compatibles pour surmonter leurs limites liées à leur réactivité avec les protéines hémiques fait partie de la stratégie. Les protéines hémiques sont responsables de la consommation rapide de HE, conduisant à la formation de E+ et de dimères. L’objectif 3 explorera le potentiel de protéger HE des protéines de l’hème et d’étendre son applicabilité aux cellules riches en hème (par exemple, les cardiomyocytes) et aux organites (mitochondries) en greffant la sonde dans des nanoparticules biocompatibles (Nano-HE) pour bloquer l’interaction de l’EH avec les centres de l’hème des protéines. L’objectif 3 explorera également le potentiel de conception de nouvelles sondes à base d’HE pour l’O2•– basées sur la chimie de l’auto-immolation. La molécule d’HE incorporée dans des nanoparticules sera dérivée avec un fluorophore, qui sera libéré sélectivement lorsque l’HE sera converti en 2-OH-E+. L’hypothèse est que l’ampleur de la libération de fluorophore libre sera une mesure spécifique de la production d’O2•–
Objectif 4. Évaluer l’applicabilité des sondes pour la détection de l’O2•– dans des systèmes biologiques modèles.
Après avoir caractérisé leur réactivité chimique et biochimique, toutes les nouvelles sondes synthétisées seront évaluées dans des systèmes cellulaires modèles afin d’évaluer leur applicabilité à la détection de l’O2•-, y compris la tolérabilité des nanoparticules synthétisées. Le laboratoire de Zielonka utilise régulièrement les modèles suivants : (i) neutrophiles activés ; (ii) les macrophages activés ; (iii) les cellules endothéliales stimulées par un agent cyclant redox ; et (iv) des mitochondries isolées en présence de donneurs d’électrons. Les expériences sur des systèmes cellulaires modèles permettront d’établir les performances des sondes dans la détection de l’O2•– et leur réponse à d’autres oxydants. Les expériences sur des mitochondries isolées utilisant différents substrats énergétiques permettront d’établir la capacité des sondes à s’accumuler dans les mitochondries et à détecter l’O2•– de différents complexes mitochondriaux. L’objectif ultime de cette thèse est de développer un ou plusieurs tests basés sur la fluorescence pour mesurer sélectivement le superoxyde mitochondrial
Complémentarité
Cette thèse de doctorat s’appuiera sur la collaboration en cours entre les laboratoires AMU et MCW, axée sur le développement de nouvelles sondes et modulateurs redox, pour relever les défis fondamentaux dans le domaine de la biologie redox. Les deux laboratoires utilisent leur formation chimique pour développer, caractériser et valider les nouvelles sondes et outils dans le domaine de la recherche redox, ils disposent d’une expertise forte et complémentaire qui se traduit par une forte collaboration et des interactions synergiques, comme en témoignent non seulement l’échange de visites scientifiques (20) mais aussi de nombreuses publications conjointes à fort impact (47 articles) et demandes de brevets (7).
Cette thèse est innovante car elle propose de développer de nouveaux outils pour la biologie/médecine redox et tirera parti du projet de recherche international SuperO2 (IRP) récemment attribué au Dr Hardy pour soutenir la collaboration entre les équipes de recherche de l’ICR et du Medical College of Wisconsin (MCW) pour relever les défis actuels dans les études du rôle du superoxyde dans la prolifération des cellules cancéreuses et le mécanisme des chimiothérapies à base de redox.
REFERENCES
1) Winterbourn C. C. Nat Chem Biol 2008, 4, 278. 2) Halliwell B.; Gutteridge J. M. C. in Free Radical in Biology and Medicine New York 4th edition 2007. 3) Cheng, G. et al. J Biol Chem 2018, 293, 10363. (4) Hardy, M. et al. ARS 2018, 28, 1416. (5) Zielonka, J.et al. Free Radic Biol Med 2018, 128, 3. (6) Cheng G. et al. Nat Commun 2019, 10, 2205. (7) Huang, M. et al. Advanced Science, 2022, e2101267. (8) Cheng, G. et al. Free Radical Biol. Med. (2023), 205, 175-187. 9) Pan, J. et al. iScience 2018, 3, 192. (10) Zielonka, J.et al. Chem Rev 2017, 117, 10043.
Contexte de travail
Installations, ressources et financement
Le laboratoire est bien équipé : système HPLC/MS/FL, HPLC semi-préparatif, lyophilisateur, spectromètres EPR, et les installations habituelles de synthèse organique sont disponibles. De plus, nous avons un accès facile à la plateforme Spectropole, qui fournit de puissants spectromètres RMN solides et liquides, des spectromètres de masse, du dichroïsme circulaire, de la diffraction des rayons X monocristallins et de l’analyse élémentaire. AFM, MEB, TEM, microscopie confocale est également disponible sur le campus.
À MCW, le personnel technique du FRRC et l’équipement requis sont disponibles pour les besoins du projet. Le FRRC est équipé de diverses technologies de pointe, notamment des systèmes HPLC avec modes de détection par absorption, fluorescence, électrochimie et spectrométrie de masse ; les analyseurs de flux extracellulaires Seahorse XF96 ; un microscope à fluorescence ; lecteurs de plaques multimodes ; et les installations de la plateforme de culture cellulaire. En outre, des installations pour les modèles in vivo de la croissance tumorale, y compris la bioluminescence et la surveillance par IRM de la croissance tumorale dans des modèles animaux, sont disponibles.
À l’Université de technologie de Lodz (LUT), l’équipement unique (y compris l’accélérateur d’électrons/système de radiolyse par impulsions) est disponible pour les études cinétiques et mécanistes des processus de transfert d’électrons. L’équipement supplémentaire comprend un spectromètre à flux arrêté, un HPLC, LC-MS et un cryostat pour les analyses spectroscopiques à basse température.
L’accès à toutes ces installations et à l’expertise appropriée du personnel de recherche est un véritable avantage pour le projet, qui va de la chimie organique et physique de base à la biologie et à la thérapie des tumeurs
Financement. Le financement de la thèse sera assuré par le CNRS.
Valorisation
Les résultats seront publiés dans des revues à comité de lecture dans le domaine de la biologie chimique. Les patènes peuvent également être déposées.
International
Possibilité de mobilité internationale au Medical College of Wisconsin (USA) pour les études cellulaires et à l’Université de technologie de Lodz (Pologne) pour les études mécanistes et cinétiques.
Profil et compétences recherchés
Le candidat aura obtenu un master en chimie moléculaire (organique, bioorganique) ou équivalent et devra être motivé pour s’impliquer dans un projet à l’interface chimie/biologie. Une bonne connaissance des techniques classiques de synthèse organique ainsi que des méthodes de purification et d’analyse est indispensable. Des notions en biochimie, en résonance paramagnétique électronique et en chimie inorganique seront appréciées. Le candidat doit être organisé, autonome, avoir de bonnes capacités de communication et un esprit d’équipe.
Niveau d’anglais.
Encadrement doctoral
Le doctorant sera en interaction directe avec ses directeurs de thèse (Dr. M. Hardy) de l’équipe SREP et Dr. J. Zielonka du MCW. Il/elle présentera son travail lors des réunions hebdomadaires du groupe.
Un comité de suivi annuel est organisé par l’école doctorale pour donner l’opportunité au doctorant de présenter ses travaux
Contraintes et risques
Pas de risques particuliers
Informations complémentaires
Il s'agit d'un contrat doctoral dans le cadre de la campagne des thèses internationales coordonnée par la MITI.
Il s'agit d'un contrat doctoral dans le cadre de la campagne des thèses internationales coordonnée par la MITI.
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