Topic description
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie pulmonaire chronique, progressive et létale avec une médiane de survie de 3-5 ans après diagnostic [1]. Les traitements approuvés pour la FPI permettent de ralentir la maladie mais n'arrêtent pas sa progression. Actuellement, il n'existe pas de biomarqueurs permettant de prédire ni de suivre la progression du processus fibrosant. Bien que la physiopathologie de la FPI reste largement incomprise, le modèle d’étude actuel repose sur une communication intercellulaire anormale entre les types cellulaires constituant le poumon [2, 3]. Des lésions de l’épithélium alvéolaire induiraient une activation anormale de ces cellules, conduisant à une dérégulation locale du système immunitaire et à l’activation de (myo)fibroblastes. Ces derniers sont des acteurs clés de la fibrose, responsables de la production d’une matrice extracellulaire anormale caractérisant la fibrose [2].
Parmi les mécanismes de la communication intercellulaire dérégulés pendant la fibrose pulmonaire, l’équipe du Pr Bonniaud étudie les vésicules extracellulaires (ou, EVs). Les EVs, qui incluent les exosomes, sont des nanovésicules lipidiques sécrétées par toutes les cellules. De taille comprise entre 50 à nm de diamètre, elles contiennent des protéines, des acides nucléiques et des lipides qui sont transportés vers une cellule cible [4]. Le rôle des EVs dans les maladies pulmonaires chroniques et la fibrose pulmonaire est un domaine actif de recherche [5]. Nous avons montré que des EVs s’accumulent dans les liquides de lavage broncho-alvéolaire (LBA) de patients avec FPI et dans les modèles animaux de fibrose pulmonaire [6]. Fonctionnellement, ces EVs exacerbent les mécanismes de la fibrose [7, 8]. Leur profil protéomique particulier révèle un enrichissement en protéines appartenant aux voies de signalisation WNT/β-caténine, ou liées à l’organisation de la matrice extracellulaire et au processus de cicatrisation des plaies [7]. Nous étudions l’intérêt des EVs comme source de biomarqueurs d’efficacité des traitements de la fibrose.
Les protéines de choc thermique (ou Heat Shock Proteins, HSPs) sont des protéines chaperonnes produites par les cellules en situation de stress (hypoxie, inflammation, etc…). Dans la FPI, plusieurs HSPs sont surexprimées et régulent la voie de signalisation pro-fibrosante du TGF-β1, la stabilisation du facteur de transcription Snail ou la synthèse de collagène [9-12]. Nous avons montré dans des modèles murins de fibrose pulmonaire, que l’inhibition des petites HSPs, HSPB1 et HSPB5, permet une diminution de la fibrose [10, 12, 13]. Nous avons breveté l’action anti-fibrosante de l’inhibition d’HSPB1 (US) et d’HSPB5 (EP .2). Les HSPs peuvent s’associer à des lipides structuraux et avoir un rôle de régulation des membranes cellulaires [14]. De plus, plusieurs études montrent qu’HSPB5 est liée à la génération des EVs [15-18] et nos données préliminaires suggèrent que la délétion d’HSPB5 entrainerait une diminution de la sécrétion des EVs dans le LBA de souris traitées par bléomycine.
Hypothèse et objectifs du projet : Notre hypothèse de travail est que les cellules participant au processus de fibrose pulmonaire sécrètent des EVs avec une activité pro-fibrotique. Ces vésicules transportent des médiateurs spécifiques et sont à ce titre, des cibles thérapeutiques et marqueurs pronostiques de choix. Leur synthèse et leur sécrétion sont régulées et la modulation de HSPB1 et HSPB5 pourraient en limiter les effets. A travers ce projet, nous voulons tester le potentiel des EVs comme source de biomarqueurs de l’efficacité de thérapies anti-fibrosantes ciblant les petites HSP via 4 objectifs comme décrit ci-dessous.
Objectif 1. Caractériser l’impact de la modulation d’HSPB5 ou d’HSPB1 dans la composition des EVs lors de la fibrose pulmonaire (0-12 mois). Des souris avec inhibition d’HSPB1 (injection d’OGX-) ou HSPB5 (SV délétés pour le gène Hspb5), et des souris contrôles (injection d’ASO contrôle, souris SV wildtype), seront exposées par voie intra-trachéale à la bléomycine pour induire une fibrose pulmonaire [19]. Nous étudierons la sécrétion d’EVs dans les LBA des souris à différents temps après injection de bléomycine correspondant aux phases d’inflammation (J7), de fibrose (J14) et de résolution (J28). Chaque souris aura également une mesure de fonction pulmonaire au moment de la récupération du LBA. Les EVs seront isolées des LBA suivant des protocoles du laboratoire [6, 20] et seront caractérisées par quantification - Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) - et protéomique en spectrométrie de masse. En parallèle, des fibroblastes MLg, avec ou sans surexpression stable d’HSPB5 ou d’HSPB1, seront cultivés en présence ou non de la cytokine pro-fibrotique TGF-β1. Les milieux conditionnés de ces cellules seront collectés pour analyse de la sécrétion d’EVs comme décrit pour les LBA.
Objectif 2. Identifier la communication cellulaire médiée par les EVs sécrétées par les cellules surexprimant HSPB5 ou HSPB1 (0-24 mois). Nous avons des données montrant que les fibroblastes sont les sécréteurs majeurs des EVs et qu’ils surexpriment HSPB1 et HSPB5 lors de la fibrose pulmonaire. Nous utiliserons les fibroblastes MLg avec surexpression stable d’HSPB5 ou d’HSPB1. Ces cellules seront utilisées pour produire des EVs qui seront marquées par fluorescence et injectées par voie intra-trachéale à des souris naïves. Le tissu pulmonaire de ces souris sera étudié par histologie et cytométrie en flux avec des marqueurs spécifiques des types cellulaires majeurs du poumon. Une étude de biodistribution à plus long terme sera réalisée après marquage des EVs avec un traceur radioactif ainsi qu’un suivi du devenir des EVs de façon longitudinale par imagerie in vivo.
Objectif 3. Etudier l’importance d’HSPB5 et d’HSPB1 dans les effets fonctionnels des EVs (6-28 mois). Nous utiliserons des EVs isolées de LBA de souris Hspb5+/+ ou Hspb5-/-, ou de souris injectées avec l’OGX- ou un ASO contrôle, et exposées à la bléomycine. Ces EVs seront utilisées sur plusieurs modèles expérimentaux. In vivo dans le modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, les EVs seront injectées par voie intra-trachéale de J10 à J16 et le développement de la fibrose sera analysé à J21 par plusieurs techniques : histologie, dosage de collagène, séquençage d’ARN à cellule unique (single cell RNA sequencing). Les résultats de ces expériences seront confirmés en utilisant des EVs de fibroblastes +/- surexpression d’HSPB5 sur des modèles expérimentaux humains dérivés de patients : fibroblastes pulmonaires primaires humains, tranches de tissu pulmonaire (precision-cut lung slices, PCLS) cultivées ex vivo et organoïdes.
Objectif 4. Développer des biomarqueurs compagnons d’une thérapie anti-fibrosante ciblant HSPB1 et HSPB5 (12-30 mois). Nous utiliserons les données générées dans les objectifs précédents (protéines dans les EVs régulées par HSPB1 ou HSPB5, voie(s) de signalisation activée(s) par des EVs dans des cellules cibles). La variation de ces paramètres sera étudiée dans plusieurs modèles murins de fibrose pulmonaire (bléomycine, surexpression de TGF-β). Ces souris recevront ou non les inhibiteurs d’HSPB1 ou d’HSPB5, seuls ou en combinaison avec le nintédanib, un des deux traitements validés de la FPI.
Ce projet s’inscrit dans l’axe de recherche développé par l’équipe sur le rôle des vésicules extracellulaires dans la fibrose pulmonaire. Ce travail sera collaboratif entre le laboratoire HSP-Pathies de l’Inserm, l’Institut Universitaire du Poumon Dijon-Bourgogne et le Centre de Référence des Maladies Pulmonaires Rares de l’Adulte du CHU de Dijon. Les infrastructures pour les modèles animaux et ex vivo, ainsi que pour l’isolation/caractérisation des EVs sont opérationnelles dans l’U. Les analyses protéomiques seront réalisées en collaboration avec le Pr E Boncoeur (CEA Grenoble), le scRNAseq et l’imagerie in vivo avec les plateformes de génomique haut-débit (Dr R Boidot) et d’imagerie et radiothérapie précliniques (Dr PS Bellaye, Dr B Collin) du CGFL à Dijon. Les modèles cellulaires dérivés de patients (fibroblastes humains primaires, PCLS et organoïdes) seront réalisés en collaboration avec le Pr PB Pages (CHU Dijon) et le Pr M Lehmann (University of Marburg, Allemagne).
Funding category
Public funding alone (i.e. government, region, European, international organization research grant)
Funding further details
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