Topic description
La transmission excitatrice rapide dans le cerveau repose sur les récepteurs glutamatergiques de type AMPA (AMPAR), dont le nombre, la localisation et la dynamique aux synapses déterminent de manière critique la force et la plasticité synaptiques. Si de nombreux mécanismes intracellulaires contrôlant le trafic des AMPAR sont aujourd'hui bien caractérisés, les interactions moléculaires extracellulaires qui organisent et stabilisent les AMPAR aux synapses restent encore mal comprises, notamment en raison de leur nature faible, transitoire et difficilement accessible par des approches conventionnelles.
Des travaux récents de l'équipe d'accueil (SNIPER) ont permis de résoudre le mécanisme structural par lequel les Pentraxines Neuronales (NP) interagissent avec les AMPAR et induisent leur regroupement aux synapses excitatrices, levant ainsi un verrou technique de longue date. Ces avancées ouvrent la voie à une nouvelle phase de recherche visant au développement d'outils moléculaires capables de cibler, manipuler et visualiser de manière sélective des interfaces NP–AMPAR définies dans des neurones vivants.
L'objectif de cette thèse est de développer et d'utiliser des mini-protéines épitope-spécifiques pour étudier l'organisation et la fonction des AMPAR aux synapses. Le projet combine la conception computationnelle de protéines et l'évolution expérimentale continue, en intégrant la conception in silico de mini-protéines à une optimisation expérimentale par évolution dirigée dans la levure (AHEAD), afin d'obtenir une liaison précise sur épitope, associée à une forte expression et à de bonnes propriétés biophysiques.
Le doctorant participera à la fois aux volets computationnels et expérimentaux du projet. Sur le plan computationnel, il sera formé à la conception et à l'analyse structurale de protéines, et contribuera à la conception, à la sélection et à l'évaluation de mini-protéines candidates. Sur le plan expérimental, il réalisera des clonages moléculaires, des expériences d'affichage sur levure, des sélections par cytométrie en flux (FACS), ainsi que la caractérisation biophysique des ligands optimisés. Les mini-protéines sélectionnées seront transformées en outils fonctionnels, soit comme bloqueurs d'interface pour perturber le regroupement des AMPAR dépendant des NP, soit comme sondes fluorescentes pour l'imagerie en temps réel et en super-résolution (uPAINT/STED) de la mobilité et de l'organisation nanométrique des récepteurs.
Ces outils seront utilisés dans des cultures neuronales afin d'étudier comment le regroupement des AMPAR médié par les NP contrôle la dynamique des récepteurs et la signalisation synaptique. En fonction de l'avancement du projet, des analyses fonctionnelles complémentaires, incluant des enregistrements électrophysiologiques dans des populations neuronales définies, pourront être réalisées. Ce projet de thèse offrira ainsi une formation interdisciplinaire à l'interface de la biologie structurale, de l'ingénierie des protéines et de la neurobiologie cellulaire.
Au final, cette thèse permettra de générer de nouvelles sondes moléculaires pour interroger l'organisation des récepteurs synaptiques, d'apporter des éléments mécanistiques sur le contrôle extracellulaire de la fonction des AMPAR, et de contribuer au développement de méthodologies computationnelles et expérimentales généralisables pour la conception et l'optimisation de ligands protéiques ciblant des interfaces biologiques complexes.
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Fast excitatory neurotransmission in the brain relies on AMPA-type glutamate receptors (AMPARs), whose number, positioning and dynamics at synapses critically determine synaptic strength and plasticity. While much is known about intracellular mechanisms controlling AMPAR trafficking, the extracellular molecular interactions that organize and stabilize AMPARs at synapses have remained poorly understood, largely because these interactions are weak, transient and difficult to study using conventional approaches.
Recent work from the host team (SNIPER) has resolved the structural mechanism by which Neuronal Pentraxins (NPs) interact with and cluster AMPARs at excitatory synapses, overcoming long-standing technical barriers. This has opened the way to a new phase of research: the development of molecular tools that can selectively target, manipulate and visualize defined NP–AMPAR interfaces in living neurons.
The goal of this PhD project is to develop and apply epitope-defined mini-protein binders to probe the organization and function of AMPARs at synapses. The project integrates computational protein design with experimental continuous evolution, combining in silico mini-protein design with yeast-based directed evolution (AHEAD) to achieve precise on-epitope binding together with high expression and biophysical robustness.
The PhD student will participate in both the computational and experimental components of this workflow. On the computational side, the student will be trained in structure-based protein design and analysis, and will contribute to the design, selection and evaluation of candidate mini-proteins. On the experimental side, the student will perform molecular cloning, yeast display, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and biophysical characterization of optimized binders. Selected mini-proteins will be converted into functional tools, either as interface blockers to perturb NP-dependent AMPAR clustering or as fluorescent probes for live and super-resolution imaging (uPAINT/STED) of receptor mobility and nanoscale organization.
These tools will be applied in neuronal cultures to investigate how NP-mediated AMPAR clustering controls receptor dynamics and synaptic signaling. Depending on progress, functional readouts may include electrophysiological measurements in defined neuronal populations. Through this project, the PhD student will receive interdisciplinary training at the interface of structural biology, protein engineering and cellular neuroscience.
Overall, this thesis will generate novel molecular probes to interrogate synaptic receptor organization, provide mechanistic insight into extracellular control of AMPAR function, and contribute to the development of generalizable computational–experimental methodologies for designing and optimizing protein binders targeting challenging biological interfaces.
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Début de la thèse : 01/10/
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