Topic description
Les cellules souches résidentes de l'épiderme adulte sont dotées de remarquables capacités d'autorenouvellement et d'organogenèse, sur lesquelles reposent le maintien à long terme de l'homéostasie de ce tissu, ainsi que son potentiel de régénération. Ces cellules constituent un modèle d'étude pour aborder le concept de réseau moléculaire déterminant le statut ‘cellule souche' ou ‘stemness' (Fortunel et al. Science ) dans un tissu humain. Approfondir la connaissance de leurs déterminants moléculaires est nécessaire pour faire progresser la bio-ingénierie des substituts cutanés, historiquement utilisés pour la greffe chez les grands brûlés (Ronfard et al. Transplantation ) et plus récemment pour des approches de thérapie génique (Hirsch et al. Nature ).
Le Laboratoire de Régénération et Radiopathologies Cutanées (LR2C) a décrit l'importance de deux facteurs de transcription, KLF4 et MXD4/MAD4, dans la régulation de la balance « immaturité versus différenciation » de ces cellules souches, en relation avec la voie de signalisation du TGFB1. Abaisser le niveau d'expression de l'un ou l'autre de ces facteurs par interférence ARN permet de mieux maintenir le caractère ‘cellule souche' en contexte d'expansion ex vivo, avec pour effet une préservation plus efficace de leur capacité à reconstruire un épiderme tridimensionnel (Fortunel et al. Nat Biomed Eng et Coutier et al. J Invest Dermatol ).
Une analyse in silico des signatures transcriptionnelles modulées en réponse à un ciblage anti-KLF4 ou anti-MXD4/MAD4 a été réalisée, pointant de manière prospective un réseau de régulation comprenant des transcrits codants et des ARNs non codants (Vinasco-Sandoval et al. Int J Mol Sci ). La réalité des mécanismes ainsi proposés doit à présent être documentés expérimentalement. Le projet de thèse s'appuiera sur ces socles de résultats pour acquérir de nouvelles connaissances sur la mécanistique des contrôles du statut ‘stemness' dans les cellules souches kératinocytaires de l'épiderme humain.
Un premier aspect abordé portera sur la convergence des réponses cellulaires contrôlées par KLF4 et MXD4/MAD4. Ce phénomène de reprogrammation cellulaire induit indépendamment par les deux facteurs sera étudié par une approche multi-OMICs visant à intégrer différents niveaux d'analyse du génome et de l'expression génique. L'analyse comprendra une cartographie des séquences cibles des facteurs de transcription KLF4 et MXD4/MAD4 à l'échelle du génome complet (ChIP-Seq), une cartographie des zones ‘ouvertes-actives' et ‘fermées-inactives' du génome en contextes cellulaires représentatifs de degrés d'immaturité distincts (ATAC-Seq), et des analyses du transcriptome sur populations et à l'échelle de la cellule unique (bulk- et single-cell-RNA-seq). Cette analyse intégrée apportera un éclairage sur l'interdépendances des mécanismes d'action de KLF4 et MXD4/MAD4.
Un second aspect abordé aura pour objet la recherche d'effets coopératifs de KLF4 et MXD4/MAD4 sur le maintien du statut ‘stemness' et la capacité régénératrice des cellules souches kératinocytaires. Considérant des mécanismes d'action au moins partiellement distincts, l'hypothèse explorée envisage la possibilité d'obtenir une réponse plus efficace en ciblant les deux facteurs, par rapport à un ciblage individuel de l'un ou l'autre. L'approche fonctionnelle reposera sur l'utilisation de modèles organoïdes épidermiques, qui seront mis à profit pour réaliser des expériences de traçage cellulaire et de régénération compétitive, à partir de cellules présentant une expression diminuée de KLF4 ou de MXD4/MAD4.
Le projet revêt ainsi une double portée : 1) au niveau recherche amont, acquisition de connaissances originales sur les mécanismes moléculaires régissant le maintien des cellules souches kératinocytaires ; 2) sur un plan translationnel, approfondissement de pistes de travail pour augmenter la capacité régénératrice de substituts de peau issus de bio-ingénierie en culture.
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Resident stem cells of the adult epidermis are endowed with remarkable self-renewal and organogenesis capacities, on which the long-term maintenance of the homeostasis of this tissue, as well as its regenerative potential, depends. These cells constitute a model for studying the concept of a molecular network that determines the ‘stem cell' or ‘stemness' status (Fortunel et al. Science ) in a human tissue. A deeper understanding of their molecular determinants is necessary to advance the bioengineering of skin substitutes, historically used for grafts in burn patients (Ronfard et al. Transplantation ) and more recently for gene therapy approaches (Hirsch et al. Nature ).
The Laboratory of Cutaneous Regeneration and Radiopathologies (LR2C) has described the importance of two transcription factors, KLF4 and MXD4/MAD4, in the regulation of the 'immaturity versus differentiation' balance of these stem cells, in relation to the TGFB1 signaling pathway. Lowering the expression level of either of these factors by RNA interference makes it possible to better maintain the ‘stem cell' character in the context of ex vivo expansion, resulting in a more effective preservation of their ability to rebuild a three-dimensional epidermis (Fortunel et al. Nat Biomed Eng and Coutier et al. J Invest Dermatol ).
An in-silico analysis of transcriptional signatures modulated in response to anti-KLF4 or anti-MXD4/MAD4 targeting was performed, prospectively pointing to a regulatory network including coding transcripts and non-coding RNAs (Vinasco-Sandoval et al. Int J Mol Sci ). The reality of the mechanisms thus proposed must now be documented experimentally. The thesis project will build upon these foundational results to acquire new knowledge on the mechanistics of stemness status controls in human epidermal keratinocyte stem cells.
A first aspect addressed will focus on the convergence of cellular responses controlled by KLF4 and MXD4/MAD4. This phenomenon of cellular reprogramming, induced independently by the two factors, will be studied using a multi-OMICs approach, aimed at integrating different levels of genome and gene expression analysis. The analysis will include genome-wide mapping of KLF4 and MXD4/MAD4 target sequences (ChIP-Seq), mapping of ‘open-active' and ‘closed-inactive' regions of the genome in cellular contexts representative of distinct degrees of immaturity (ATAC-Seq), and population-level and single-cell transcriptome analyses (bulk- and single-cell-RNA-seq). This integrated analysis will shed light on the interdependencies of the mechanisms of action of KLF4 and MXD4/MAD4.
A second aspect addressed will focus on the search for cooperative effects of KLF4 and MXD4/MAD4 on maintaining 'stemness' status and the regenerative capacity of keratinocyte stem cells. Considering at least partially distinct mechanisms of action, the hypothesis explored considers the possibility of obtaining a more effective response by targeting both factors, compared to targeting only one or the other. The functional approach will rely on the use of epidermal organoid models, which will be used to perform cell tracing and competitive regeneration experiments, using cells exhibiting decreased expression of KLF4 or MXD4/MAD4.
The project thus has a dual scope: 1) at the upstream research level, acquisition of original knowledge on the molecular mechanisms governing the maintenance of keratinocyte stem cells; 2) on a translational level, further development of avenues to increase the regenerative capacity of bioengineered skin substitutes in culture.
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Début de la thèse : 01/10/
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