Caractérisation dynamique et multiparamétrique de l'activité des canaux ioniques intracellulaires par sondes bret // dynamic and multiparametric characterization of intracellular ion channel activity using bret-based probes

Topic description

Le criblage de nouveaux médicaments ciblant les canaux ioniques reste une activité complexe car les techniques de référence utilisées en criblage industriel (patch-clamp et sondes fluorescentes) ne donnent accès à l'activité d'un canal que de manière indirecte : on ne mesure pas directement l'activité du canal mais la variation de potentiel membranaire, le passage d'un ion ou le courant ionique entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule, ce qui génère des biais expérimentaux. Les sondes à cations sont ainsi souvent utilisées lors d'un crible primaire mais engendrent un nombre important de faux positifs. Le patch-clamp, qui est la technique de référence, tend à être automatisé mais reste extrêmement coûteux et n'est réellement adapté qu'à un criblage à moyen débit.
Nous avons montré, en prenant comme modèle d'étude le canal TRPV1, que des sondes basées sur la technique du Transfert d'Énergie en Résonance de Bioluminescence (BRET) permettent de mesurer en temps réel et sur cellules vivantes plusieurs évènements moléculaires directement liés à l'activité du canal étudié, comme les interactions protéine-protéine engagées par les canaux ioniques, l'endocytose, le routage et les changements de conformation des canaux lors de leur activation, ou encore la variation spécifique des cations Ca2+ et K+ dans l'environnement du pore d'un canal suite à son ouverture. Ces évènements moléculaires ne sont pas mesurables à l'aide des techniques classiques d'analyse des canaux ioniques. La diversité des sondes BRET mises en place permet aujourd'hui d'envisager l'étude multiparamétrique de l'action des ligands dans le temps lors d'une campagne de criblage à haut débit d'analyse. Mieux encore, l'utilisation du BRET permet d'étudier en temps réel sur cellules vivantes le fonctionnement des canaux intracellulaires (comme les canaux lysosomiaux).
Cette thèse vise à préciser la pharmacologie moléculaire de canaux cationiques TRPV1, P2X4 et TRPML1 lorsqu'ils sont exprimés dans le réticulum endoplasmique, sur la membrane mitochondriale (TRPV1), ou sur la membrane lysosomiale (P2X4 et TRPML1). Dans un deuxième temps, à l'aide des différentes sondes BRET utilisées sur chaque canal, nous réaliserons le criblage multiparamétrique à haut débit d'analyse d'une banque de 50, composés chimiques issus de la chimiothèque nationale pour trouver de nouveaux ligands ciblant ces canaux ioniques. Ce crible, qui sera réalisé au format puits pour accélérer l'obtention des résultats, demandera à mettre en place une analyse novatrice et automatisée des signatures temporelles générées.
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The screening of new drugs targeting ion channels remains a complex activity, as the reference techniques used in industrial screening (patch-clamp and fluorescent probes) only give access to the activity of a channel in an indirect way: we don't directly measure the activity of the channel but the variation in membrane potential, the passage of an ion or the ionic current between the outside and inside of the cell, which generates experimental biases. Cation probes are therefore often used in primary screening, but generate many false positives. Patch-clamp, the reference technique, tends to be automated but remains extremely expensive and is only really suitable for medium-throughput screening.
Using the TRPV1 channel as a model, we have shown that probes based on the Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) technique can be used to measure, in real-time and on living cells, several molecular events directly linked to the activity of the channel under study, These include protein-protein interactions, endocytosis, channel routing and conformational changes upon activation, and specific variations in Ca2+ and K+ cations in the pore environment following channel opening. These molecular events cannot be measured using conventional ion channel analysis techniques. The diversity of BRET probes now available means that ligand action can be studied multiparametrically over time, as part of a high-throughput screening campaign. Better still, using BRET makes it possible to study the functioning of intracellular channels (such as lysosomal channels) in real time on living cells.

This thesis aims to clarify the molecular pharmacology of TRPV1, P2X4 and TRPML1 cation channels when expressed in the endoplasmic reticulum, on the mitochondrial membrane (TRPV1), or on the lysosomal membrane (P2X4 and TRPML1). Secondly, using the different BRET probes used on each channel, we will carry out high throughput multiparametric screening of a bank of 50, chemical compounds from the national chemical library to find new ligands targeting these ion channels. This screening, which will be carried out in -well format to speed up results, will require innovative, automated analysis of the time signatures generated.
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Début de la thèse : 01/10/

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Contrat doctoral libre