Caractérisation d'une nouvelle hémoprotéine cyanobactérienne présentant une rare liaison axiale de l'hème // characterization of a new cyanobacterial hemoprotein with the rare his/cys heme axial ligation

Topic description

Tll est une protéine hémique de type-c récemment identifiée dans la cyanobactérie thermophile Thermosynechococcus vestitus (T. vestitus) [1,2]. Les cytochromes de type-c sont des hémoprotéines ubiquitaires principalement impliquées dans le transfert d'électrons. Le groupe hème est constitué d'un cation de fer, Fe2+ ou Fe3+, lié au centre d'une porphyrine. Quatre atomes d'azote de la porphyrine se lient au fer, laissant deux positions de coordination axiale disponibles pour se lier à la protéine ou à des gaz. Dans les cytochromes de type-c, le cycle porphyrinique de l'hème est lié de manière covalente à la protéine par deux Cys et les schémas de liaison axiale de l'hème les plus courants sont les liaisons His/His, His-Met et, His/Tyr [3]. Tll présente la liaison axiale His/Cys, rare dans les cytochromes de type-c (Fig1). Une douzaine d'hémoprotéines présentant une liaison axiale His-Cys ont été identifiées, dont plusieurs sont impliquées dans le métabolisme du souffre [4, 5, 6]. Une recherche par homologie BLAST a permis d'identifier que tll et ses homologues se trouvent dans le même opéron que le gène de la sulfure:quinone-oxydoréductase [SQR, 2]. Ces résultats suggèrent un rôle possible de Tll dans le métabolisme du souffre. Tll pourrait être une protéine de transfert d'électrons ou un capteur de gaz. L'objectif de ce projet de doctorat est d'identifier la fonction de Tll.
La coordination axiale de l'hème modifie les propriétés physico-chimiques de la protéine. Par exemple, les hèmes de type-c avec liaison axiale His/Cys ont généralement un Em beaucoup plus bas que les autres cytochromes [2, 4, 5, 6]. Le remplacement d'acides aminés dans la protéine qui modifie le schéma de coordination du fer est donc une stratégie très utile pour comprendre la fonction d'une protéine redox. Cette approche sera utilisée pour identifier la fonction de Tll entre les fonctions proposées.
Nous allons générer des mutants par mutagenèse dirigés du site de liaison de l'hème de Tll. Nous allons remplacer le ligand axial Cys de l'hème de Tll par un résidu His (Cys68His) et un résidu Ala (Cys68Ala). L'Em du His-His Tll dans le mutant Cys68His augmentera par rapport à celui du WT (His-Cys) Tll, ce qui changera sa fonction biologique. La substitution de Cys par Ala dans Tll (Cys68Ala) modifiera quant à elle le schéma de coordination du fer, qui passera d'un hème à six coordinations à un hème à cinq coordinations, affectant à la fois l'Em et les propriétés de liaison au gaz. De plus, les deux Cys conservées qui se lient de manière covalente à l'hème de type-c seront mutées en deux Ala (Cys/Ala), soit pour éviter l'insertion de l'hème dans la protéine, soit pour convertir Tll en un hème de type-b.
Les protéines WT et Tll mutées seront purifiées et leur capacité à se lier aux gaz dans des conditions oxydées et réduites sera mesurée par spectroscopie d'absorption UV-visible et par spectroscopie RPE. Ensemble, ces techniques permettront d'étudier les altérations de la structure de l'hème induites par les changements dans la liaison du fer et l'état d'oxydation.
Les protéines Tll mutées seront ensuite caractérisées par spectro-électrochimie (UV-Vis et IR moyen et lointain). La spectro-électrochimie UV-Vis fournira des informations sur l'Em des protéines Tll mutées. Les propriétés redox de la Tll mutée seront également étudiées à l'aide de la spectro-électrochimie différentielle dans les régions IR moyen et lointain. La gamme IR moyen fournit des informations sur la conformation des protéines et sur les modes des chaînes latérales des acides aminés, tandis que les signatures métal-ligand contribuent au domaine IR lointain [5,6]. Le potentiel redox et les structures de liaison métallique seront comparés à ceux du Tll WT [2]. Les souches présentant une liaison axiale His-Cys hémique mutée seront aussi testées pour leur capacité de croissance dans différentes conditions de culture.
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Tll is a c-type heme protein recently identified in the thermophylic cyanobacterium Thermosynechococcus vestitus (hereafter T. vestitus) [1,2]. Type-c cytochromes are ubiquitous hemoproteins principally involved in electron transfer processes. The heme group consists of an iron cation, Fe2+ or Fe3+ that is bound in the center of a porphyrin ring. Four nitrogen atoms of the porphyrin bind the iron leaving two axial coordination positions of the iron available for bonding with the protein or gases. In type-c cytochromes, the porphyrin ring of the heme is covalently bound to the protein through two conserved Cys and the most common heme axial ligation patterns are His/His, His-Met and to a lesser extent His/Tyr ligations [3]. Tll has the rare His/Cys heme axial ligation (Fig1). Overall, about a dozen hemoproteins were identified having His-Cys axial ligation and several are involved in the sulfide metabolism [4, 5, 6]. BLAST homology search found that tll and homology sequences of tll in cyanobacteria are the same operon with a sulfide:quinone-oxidoreductase gene [SQR, 2]. These findings suggests a possible implication of Tll into the sulfide metabolism. Tll could be electron transfer protein or be a gas/redox sensor binding gas through its His/Cys axial ligation of the heme group.
The aim of this PhD project is to identify the function of Tll.
The axial coordination of the heme affects the chemical-physical properties of the protein. For instance, c-type hemes with His/Cys axial ligation generally have a much lower midpoint potential (Em) than other cytochromes [2, 4, 5, 6]. Amino acid replacement of the protein features that alters the coordination scheme of the iron is therefore a very useful strategy to understand mechanistic aspects of a redox protein. This approach will be used to decipher between the possible functions proposed for Tll.
We will generate site-directed mutants of the heme-binding site of Tll in a naturally overexpressing strain of T. vestitus. We will substitute the axial Cys heme ligand of Tll both with a His (Cys68His) and an Ala (Cys68Ala) residues. The Em of the His-His Tll in the Cys68His mutant will increase compared to that of WT (His-Cys) Tll affecting its biological function. The Cys to Ala substitution in Tll (Cys68Ala) will instead alter the coordination scheme of the iron that will change from a six-coordinated to a five-coordinated heme affecting both Em and gas binding properties. Moreover, the two conserved Cys that covalently bind the c-type heme of Tll will be mutated into two Ala (Cys/Ala), either to avoid heme insertion into the protein or to convert Tll into a b-type heme.
The WT and the mutated Tll proteins will be purified and theirs capacity to bind gases in both oxidized and reduced conditions will be measured by UV-visible absorption spectroscopy, and EPR spectroscopy for the oxidized form. Altogether, these techniques will probe alterations in heme structure induced by changes in the iron ligation and oxidation state.
The mutated Tll proteins will be then characterized by spectro-electrochemistry (UV-Vis and Mid- and Far-IR domains). The UV-Vis spectro-electrochemistry will inform on the Em of the Tll mutated proteins. The redox properties of mutated Tll will be also probed using FT-IR difference spectroscopy coupled with electrochemistry in the Mid- and Far-IR regions. The Mid-IR range gives information on the protein conformation and on amino acid sides-chain modes, while the metal-ligand signatures are contributing to the Far-IR domain [5,6]. Redox potential and metal-binding structures will be compared to those of the WT Tll, data already available [2, Zuccarello et al., unpublished]. The strains with mutated heme His-Cys axial ligation will be tested for their ability to grow in different conditions and the PSII activity will be assessed.
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Début de la thèse : 01/10/

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Contrats ED : Programme blanc GS-Chimie