Topic description
L'objectif principal de la thèse sera de produire et purifier des lipoxygénases eucaryotiques (levure, rat/souris ou humaine) en vue de décortiquer leurs mécanismes enzymatiques in vitro, leurs spécificités de substrats et in fine leur mode d'action sur les mitochondries issues de la même espèce. Le sang est rare et précieux et des pénuries sont régulières. Un challenge mondial est la fabrication de sang ex vivo qui pourrait être utilisé pour transfuser des patients. Un postulat de la littérature concerne le rôle de la 15-lipoxygénase humaine dans l'involution mitochondriale lors du passage du réticulocyte à l'érythrocyte au cours de l'hématopoïèse. Des protocoles de production de sang ex vivo sont disponibles dans la littérature, mais un verrou, lors de ce passage des réticulocytes en érythrocytes, empêche d'obtenir des rendements suffisants pour envisager une production de sang à grande échelle destinée aux transfusions des patients. Dans ce cadre, une étude approfondie du rôle de la lipoxygénase in vitro puis sur des systèmes plus complexes est envisagée en vue d'optimiser le protocole de fabrication de sang ex vivo au niveau de la dernière étape de fabrication des érythrocytes. Différents modèles vont être utilisés. Tout d'abord, différentes lipoxygénases de levure, de rat, ou de souris et d'origine humaine seront produites et caractérisées. Différents modes de production seront envisagés allant d'une production hétérologue chez Escherichia coli, Pichia pastoris ou encore in vitro avec des extraits de réticulocytes de lapin afin de disposer d'enzymes pures à homogénéité et en quantité suffisante pour envisager des études de caractérisation enzymatique. Des tests d'activité seront mis au point sur des substrats lipidiques simples, en vésicules de composition lipidique contrôlée, puis sur mitochondries. Une étude par microscopie par force atomique permettra de visualiser les enzymes qui sont de très grande taille seules en solution mais également de suivre leur capacité à former des pores dans la membrane mitochondriale ou des doubles couches lipidiques par formation de complexes de haut poids moléculaire (i.e. la formation d'octamères membranaires par la 15-lipoxygénase humaine). Une caractérisation fine in vitro de différents couples lipoxygénase/substrat lipidique permettra de généraliser ou non un mécanisme enzymatique pour les lipoxygénases étudiées, d'évaluer les quantités minimales d'enzyme nécessaires pour la réalisation de pores dans les membranes. Une approche bottom-up sera utilisée en partant de systèmes modèles minimaux à l'utilisation sur des organites plus complexes, ce qui est un préalable et ce qui permettra d'envisager des études plus poussées pour l'utilisation des lipoxygénases dans des protocoles de fabrication de sang ex vivo.
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The main objective of this PhD project will be to produce and purify eukaryotic lipoxygenases (from yeast, rat/mouse, or human origin) to decipher their enzymatic mechanisms in vitro, their substrate specificities, and ultimately their mode of action on mitochondria derived from the same species. Blood is a rare and precious resource, and shortages occur regularly. A major global challenge is the ex vivo production of blood that could be used for patient transfusion. A prevailing hypothesis in the literature concerns the role of human 15-lipoxygenase in mitochondrial involution during the transition from reticulocytes to erythrocytes in the course of hematopoiesis. Although protocols for ex vivo blood production are available in the literature, a major bottleneck at this reticulocyte-to-erythrocyte transition prevents achieving yields sufficient for large-scale blood production intended for transfusion. In this context, an in-depth investigation of the role of lipoxygenase, first in vitro and then in more complex systems, is proposed to optimize ex vivo blood manufacturing protocols at the final stage of erythrocyte production. Several experimental models will be employed. First, lipoxygenases from yeast, rat, mouse, and human origins will be produced and characterized. Different production strategies will be considered, ranging from heterologous expression in Escherichia coli or Pichia pastoris to in vitro synthesis using rabbit reticulocyte lysates, to obtain homogeneous, highly pure enzymes in quantities sufficient for enzymatic characterization studies. Activity assays will be developed using simple lipid substrates, lipid vesicles with controlled compositions, and subsequently isolated mitochondria. Atomic force microscopy will be used to visualize these very large enzymes in solution and to monitor their ability to form pores in mitochondrial membranes or lipid bilayers through the assembly of high-molecular-weight complexes (i.e., the formation of membrane-associated octamers by human 15-lipoxygenase). Detailed in vitro characterization of different lipoxygenase–lipid substrate pairs will make it possible to determine whether a common enzymatic mechanism can be generalized across the lipoxygenases studied and to assess the minimal enzyme concentrations required for pore formation in membranes. A bottom-up approach will be adopted, progressing from minimal model systems to more complex organelles, providing an essential foundation for future, more advanced studies aimed at exploiting lipoxygenases in ex vivo blood production protocols.
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Début de la thèse : 01/10/
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