Étude de l'architecture atypique des nrps impliquées dans la biosynthèse des pyrrolamides en vue d'une optimisation de la production de peptides non ribosomaux // study of the atypical architecture of nrpss involved in pyrrolamide biosynthesis with a view

Topic description

Contexte :
Les métabolites spécialisés, produits par des micro-organismes ou des plantes, jouent des rôles écologiques majeurs (compétition, communication, signalisation) et présentent un intérêt médical (antibiotiques, anticancéreux, etc.) ou agricole (antifongique...). Parmi eux, les pyrrolamides (ex. : congocidine, distamycine) sont synthétisés par des NRPS (Non-Ribosomal Peptide Synthetases), des enzymes modulaires responsables de l'assemblage de peptides complexes. Contrairement à la plupart des NRPS, organisées en modules fusionnés (architecture canonique), les NRPS des pyrrolamides sont composées de domaines ou modules discrets, une organisation rare et mal comprise.
Problématique :
Une étude récente sur les PKS (polycétide synthases) suggère qu'une structure en petites sous-unités favorise la production de métabolites. Cette découverte soulève une question : l'architecture atypique des NRPS des pyrrolamides optimise-t-elle leur biosynthèse ? Comprendre les mécanismes moléculaires régissant les interactions entre leurs sous-unités pourrait alors ouvrir des perspectives pour la biologie de synthèse des NRPS.
Objectifs :
1. Reconstituer une architecture canonique de la NRPS produisant la congocidine, en fusionnant progressivement les domaines/modules discrets la constituant et en évaluant l'impact de ces fusions sur la production de congocidine dans un hôte hétérologue.
2. Identifier les régions d'interaction entre sous-unités de la NRPS produisant la congocidine, par une combinaison d'approches in vivo (biosynthèse combinatoire), in vitro (empreinte protéique par spectrométrie de masse) et in silico (modèles structuraux, co-évolution). Les résidus identifiés comme cruciaux pour les interactions seront validés par des mutagénèses ciblées.
3. Analyser la localisation cellulaire de NRPS de la congocidine dans les hyphes de Streptomyces ambofaciens via imagerie de fluorescence (protéines de fusion fluorescentes ou marquage HaloTag).

Enjeux :
Ce projet vise à élucider les liens entre architecture enzymatique, interactions protéine-protéine et efficacité biosynthétique, avec des applications potentielles pour l'ingénierie des NRPS et la production optimisée de composés bioactifs.
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Context:
Specialised metabolites produced by microorganisms or plants play major ecological roles (competition, communication, signaling) and are of medical (antibiotics, anticancer agents, etc.) or agricultural (antifungal compounds, etc.) interest. Among these, pyrrolamides such as congocidine or distamycin are synthesized by nonribosomal peptide synthetases (NRPSs), modular enzymes responsible for the assembly of complex peptides. Unlike most NRPSs, which are organised as fused modules (canonical architecture), pyrrolamide NRPSs are composed of discrete domains or modules, a rare and poorly understood organisation.

Hypothesis :
A recent study on polyketide synthases (PKSs) suggests that an organization into small subunits favors metabolite production. This finding raises a key question: does the atypical architecture of pyrrolamide NRPSs optimize their biosynthesis? Understanding the molecular mechanisms governing interactions between their subunits could open new perspectives for NRPS synthetic biology.

Objectives:

1. Reconstruct a canonical architecture of the congocidine-producing NRPS by progressively fusing its discrete domains/modules and assessing the impact of these fusions on congocidine production in a heterologous host.

2. Identify interaction regions between subunits of the congocidine-producing NRPS using a combination of in vivo approaches (combinatorial biosynthesis), in vitro methods (Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting), and in silico analyses (structural modeling, co-evolution). Residues identified as crucial for interactions will be validated by targeted mutagenesis.

3. Analyse the cellular localisation of the congocidine NRPS in the hyphae of Streptomyces ambofaciens using fluorescence imaging (fluorescent fusion proteins or HaloTag labeling).

Significance:
This project aims to elucidate the links between enzymatic architecture, protein–protein interactions, and biosynthetic efficiency, with potential applications in NRPS engineering and the optimised production of bioactive compounds.
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Début de la thèse : 01/10/

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Contrats ED : Programme blanc GS-LSaH