Topic description
La maladie de Parkinson se caractérise par une dégénérescence progressive des neurones et l'accumulation d'agrégats d'α-synucléine (α-syn). Des données croissantes soutiennent un mécanisme de type prion par lequel la pathologie α-syn se propage entre régions cérébrales connectées, mais les mécanismes cellulaires restent incomplètement élucidés .
Les tunneling nanotubes (TNTs) sont des ponts intercellulaires dépendants de l'actine permettant le transfert direct de protéines, d'organites et de signaux. Nous avons montré en modèles neuronaux 2D que les agrégats d'α-syn se localisent dans les TNTs et se propagent entre neurones et cellules gliales. De plus, l'accumulation d'α-syn favorise la formation de TNTs, suggérant un mécanisme d'amplification de la propagation pathologique (2–5).
Les dysfonctionnements mitochondriaux et lysosomaux contribuent fortement à la neurodégénérescence. Nos données dans des lignées cellulaires et des neurones et microglies dérivés d'iPSC montrent que les agrégats d'α-syn induisent fragmentation mitochondriale, altération lysosomale et activation inflammatoire (6,7). La libération d'ADN mitochondrial active la voie cGAS–STING, augmentant la formation de TNTs et reliant stress organellaire, inflammation et propagation intercellulaire .
L'existence et la fonctionnalité des TNTs dans un tissu cérébral humain restent cependant inconnues. Nos données dans le cerveau murin et des travaux publiés indiquent la présence de structures de type TNT in vivo (3,8,9,10). De plus, nous avons démontré chez l'embryon de poisson zèbre des structures fonctionnelles capables de transférer protéines et organites dans un tissu vivant .
Pour répondre à cette question, ce projet utilisera des organoïdes mésencéphaliques humains dérivés d'iPSC de patients porteurs d'une triplication de SNCA, ainsi que des contrôles isogéniques corrigés et WT. Ce modèle, établi au laboratoire, reproduit l'architecture mésencéphalique et l'agrégation endogène d'α-syn (Fig.1). Le laboratoire dispose d'outils viraux, d'imagerie en temps réel et super-résolution, et de stratégies de quantification des TNTs, garantissant la faisabilité du projet.
Objectif général et aims:
Déterminer si les TNTs contribuent à la propagation intercellulaire de l'α-syn dans des organoïdes humains et identifier les voies moléculaires régulant leur formation en conditions pathologiques.
1. Caractériser la formation de TNTs
Quantifier les structures de type TNT dans des organoïdes SNCA triplication versus contrôles isogéniques et WT, à l'aide de tranches transduites par des rapporteurs fluorescents ciblant membrane et mitochondries (Fig.2). Le marquage mosaïque permettra une visualisation haute résolution des protrusions et du transfert de cargos par microscopie confocale, immunofluorescence et super-résolution (11,13).
2. Analyser la localisation et le transfert d'α-syn
Étudier la localisation des agrégats endogènes d'α-syn (mitochondries, lysosomes, protrusions TNT). La propagation sera évaluée par micro-injection de fibrilles fluorescentes suivie d'imagerie en temps réel .
3. Valider les voies régulatrices
À partir de données 2D montrant un transfert accru d'α-syn dans les neurones SNCA triplication, des analyses RNA-seq et protéomiques en progress dans le labo identifieront des régulateurs candidats. Ceux-ci seront validés par surexpression, knockdown, CRISPRi/a et approches pharmacologiques en 2D et organoïdes. Les voies EPS8, MYO10, WNT et inflammatoires/STING impliquées dans la formation des TNTs.
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Parkinson's disease is characterized by progressive neurons degeneration and accumulation of α-synuclein (α-syn) aggregates. Increasing evidence supports a prion-like mechanism in which α-syn pathology spreads between connected brain regions. However, the cellular mechanisms underlying this propagation is incompletely understood .
Tunneling nanotubes (TNTs) are actin-based intercellular bridges that enable direct cell-to-cell transfer of proteins, organelles, and signaling molecules. Our group previously demonstrated in 2D neuronal models that α-syn aggregates localize within TNTs and spread between neurons and glial cells through them. Importantly, α-syn accumulation promotes TNT formation, suggesting a feed-forward mechanism that could amplify pathological propagation (2–5).
Beyond protein spreading, mitochondrial and lysosomal dysfunction are central contributors to neurodegeneration. Our recent data in cell lines and iPSC-derived neurons and microglia show that α-syn aggregates induce mitochondrial fragmentation, lysosomal impairment, and inflammatory activation (6,7). Notably, mitochondrial DNA release activates the cGAS–STING pathway, which enhances TNT formation, functionally linking organelle stress, inflammation, and intercellular propagation .
Despite these advances, whether TNTs exist and function in the human brain remains unknown. Our data in fixed mouse brain, together with published reports, indicate the presence of TNT-like structures in vivo (3,8,9,10). Moreover, our recent live imaging studies in zebrafish embryos demonstrated functional TNT-like structures capable of transferring proteins and organelles in living vertebrate tissue .
To directly address this gap, this PhD project will use human midbrain organoids derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) from PD patients carrying an SNCA triplication, together with isogenic corrected and WT controls. This organoid model is already established in the laboratory and recapitulates midbrain architecture and endogenous α-syn aggregation (Fig.1).
Importantly, in addition to iPSCs derived culture, the laboratory has established viral tools, live imaging pipelines, super-resolution microscopy workflows, and TNT quantification strategies, ensuring feasibility and generation of publishable results within the doctoral timeframe.
Objective and aims:
To determine whether TNTs contribute to α-syn intercellular spreading in human midbrain organoids and to identify molecular pathways regulating TNT formation under pathological conditions.
1. Characterize TNT formation in PD midbrain organoids
Quantify TNT-like structures in SNCA triplication organoids versus isogenic and wild-type controls using organoid slices transduced with membrane- and mitochondria-targeted fluorescent reporters (Fig.2). Mosaic labeling will enable high-resolution visualization of intercellular protrusions and cargo transfer by live confocal, fixed immunofluorescence, and super-resolution microscopy as previously shown in zebrafish gastrula and 2D cultures (11,13).
2. Determine α-syn aggregate localization and TNT-mediated transfer
Assess endogenous α-syn aggregate localization in organoid slices focusing on associations with mitochondria, lysosomes, and TNT-like protrusions. Intercellular spreading will be evaluated by microinjecting fluorescent α-syn fibrils into organoid slices followed by time-lapse imaging .
3. Validate molecular pathways regulating TNT formation
Building on preliminary 2D data showing enhanced α-syn transfer in SNCA triplication neurons, the lab is performing integrate RNA-seq and quantitative proteomics to identify candidate regulators. Identified pathways will be validated by the student by overexpression, knockdown, CRISPRi/a, and pharmacological approaches in 2D cultures and organoids. EPS8, MYO10, WNT, and inflammatory/STING signaling previously shown to be involved in TNT formation in 2D (7,14,15,16) will be also examined.
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Début de la thèse : 01/10/
Funding category
Public funding alone (i.e. government, region, European, international organization research grant)
Funding further details
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