Établissement du programme de réplication dans les cellules naissantes // establishment of the dna replication program in new born cells

Topic description

Le programme de réplication de l'ADN définit comment et quand l'ADN est répliqué. Il repose sur la préparation (licensing) des origines de réplication de l'ADN en fin de mitose et la phase G1 et leur activation pendant la phase S. Bien qu'il ait fait l'objet d'études approfondies dans les cellules en cycle cellulaire, la manière dont ce programme s'établit lors de la formation d'une nouvelle cellule de levure n'a jamais été étudiée. Pour ce faire, nous utilisons des spores, les gamètes de la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, qui sont de nouvelles cellules de levure produites lorsque des cellules diploïdes subissent la méiose.
À l'aide d'un pipeline de détection directe du BrdU par séquençage Nanopore de longs fragment, développé en laboratoire et permettant de déterminer l'efficacité d'activation des origines à l'échelle du génome, nous montrons que, comme observé chez les embryons de souris à 1 et 2 cellules (Takahashi S. et al., ), les spores au cours de leur premier cycle cellulaire ne partagent pas de programme commun de réplication de l'ADN par rapport aux cellules cyclantes. Nos mesures par peignage moléculaire de l'ADN révèlent une diminution de 50 % de la densité des origines lors de ce premier cycle cellulaire des spores en germination par rapport aux cellules cyclantes. Cette diminution pourrait être responsable d'un programme de réplication de l'ADN spécifique à chaque spore, rappelant les observations faites en laboratoire avec une inactivation partielle des facteurs de licensing. Cependant, les spores en germination ne présentent aucune instabilité génomique. Probablement parce qu'elles activent correctement la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN en réponse à un agent génotoxique et, fait intéressant, régulent différemment le métabolisme des dNTP. En effet, nos analyses protéomiques quantitatives indiquent qu'elles contiennent deux fois plus de protéines impliquées dans la synthèse des dNTP que les cellules cyclantes.
Dans le cadre de ce projet, l'étudiant étudiera les origines et les conséquences de cette réplication de l'ADN non partagée dans les spores de levure en germination. L'étudiant déterminera (i) les spécificités du premier cycle cellulaire après la germination des spores (durée des phases du cycle cellulaire, niveaux d'expression des facteurs de réplication de l'ADN, notamment Orc1-6 et Mcm2-7, et des régulateurs du cycle cellulaire, dont les cyclines), (ii) les sites de liaison des facteurs de réplication de l'ADN, notamment Orc1-6 et Mcm2-7, par ChIP-seq ou l'approche CUT&RUN, (iii) la vitesse des fourches de réplication à l'aide du peignage moléculaire de l'ADN et du séquençage Nanopore, et (iv) la structure de la chromatine et l'organisation 3D du génome à l'aide du séquençage Nanopore et des approches HI-C. Ces travaux seront menés à l'aide de techniques sophistiquées d'analyse de la réplication développées ou en cours de développement dans le laboratoire d'accueil, notamment le peignage moléculaire de l'ADN et le séquençage Nanopore (Schwob et al., ; Talarek et al., ; Montecchi & Schwob, ; Barba Tena et al., ; Barba Tena et al., soumis à Molecular Cell). L'étudiant aura également recours à la génétique moléculaire de la levure et à la microscopie à haute résolution.
Ces travaux novateurs pourraient révéler les mécanismes cellulaires, probablement conservés, qui contribuent à la mise en place du programme de réplication de l'ADN dans les cellules naissantes.
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The DNA replication program defines how and when DNA is replicated. It relies on the licensing and firing of DNA replication origins in late mitosis and G1, and S, respectively. Although it has been extensively studied in cycling cells, how such a program is established when a new yeast cell is generated has never been investigated. To do so, we use spores, the budding yeast gametes, which are new yeast cells produced when diploid cells undergo meiosis.
Using a pipeline for direct BrdU detection on long nanopore sequencing reads, which allows to determine origin firing efficiencies genome-wide developed in the lab, we show that, as observed in 1 and 2-cell mouse embryos (Takahashi S. et al., ), germinating spores in their 1st cell cycle do not share a common DNA replication program compared to cycling cells. Our DNA combing measurements reveal a 50%-decrease of origin density in the first cell cycle of germinating spores compared to cycling cells. This under-licensed state could responsible for the undefined DNA replication program, reminiscent of observations made in the lab with partial inactivation of licensing factors. However, germinating spores do not exhibit any genome instability, probably because they correctly activate the cellular response to DNA damage in response to a genotoxic agent and, interestingly, regulate dNTP metabolism differently, since our quantitative proteomic analyses indicate that they contain twice as many proteins involved in dNTP synthesis as cycling cells.
In this project we will investigate the origins and the consequences of this unshared DNA replication in germinating yeast spores. The student will determine (i) the specificities of the first cell cycle after spore germination (cell cycle phase duration, expression levels of DNA replication factors, including Orc1-6 and Mcm2-7, and cell cycle regulators, including cyclins), (ii) the binding sites of DNA replication factors, including Orc1-6 and Mcm2-7, by ChIP-seq or CUT&RUN approach, (iii) the velocity of replication forks using DNA combing and Nanopore sequencing, and (iv) the structure of the chromatin and the 3D genome organization using nanopore sequencing and HI-C approaches. This will be done using sophisticated replication analysis techniques developed or currently in development in the host lab, including DNA molecular combing, Nanopore sequencing (Schwob et al., ; Talarek et al., ; Montecchi & Schwob, ; Barba Tena et al., ; Barba Tena et al., submitted to Molecular Cell). The student will also employ yeast molecular genetics and high-resolution microscopy.
This ground-breaking work could reveal the, likely conserved, intimate cellular mechanisms contributing to the establishment of the DNA replication program in new born cells.
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Début de la thèse : 01/10/

Funding category

Public funding alone (i.e. government, region, European, international organization research grant)

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Concours pour un contrat doctoral