Visualiser la traduction des arnm dans les cellules vivantes // visualize rna translation in live cells

Topic description

La traduction est une étape fondamentale de l'expression des gènes qui permet une grande partie de la régulation génique, que ce soit au niveau d'un ARNm spécifique ou de l'ensemble du transcriptome. Les chercheurs ont déployé des décennies d'efforts pour développer des technologies permettant de mesurer la traduction. Nous avons maintenant des méthodes biochimiques puissantes, telles que le Ribo-Seq, Nous disposons également de méthodes de microscopie pour visualiser la traduction de molécule uniques d'ARNm, qui ont été développées par plusieurs équipes dont la nôtre. Ces méthodes ont profondément changé l'étude de la traduction. Cependant, malgré ces progrès importants, il est toujours aussi difficile de visualiser la traduction du transcriptome dans son ensemble. Or, ceci est très important car la traduction est régulée à l'échelle du transcriptome entier par des voies cellulaires clés telles que la signalisation mTOR, qui régule la croissance cellulaire en fonction des nutriments. En visualisant de manière globale la traduction dans les cellules vivantes, il sera possible de dire quand et où la traduction se produit, et ainsi d'accéder à de nouvelles informations, telles que: (i) la variation de la quantité de synthèse protéique d'une cellule à l'autre; (ii) la régulation temporelle de la traduction au niveau de cellules uniques; (iii) l'identification des compartiments intracellulaires dans lesquels la traduction se produit.
L'objectif général de la thèse est de développer et d'utiliser une nouvelle méthode qui permet de visualiser la traduction de manière globale, à l'échelle du transcriptome entier et dans des cellules vivantes. Ce sera une avancée décisive et nous prévoyons que cela aura un impact important pour comprendre la régulation de l'expression des gènes. Pour ce faire, le candidat développera un biosenseur fluorescent qui s'allume lorsque les sous-unités ribosomales se joignent au début de la traduction d'un ARNm, et qui s'éteint lorsque les sous-unités ribosomales se séparent après la fin de la traduction. Notre équipe a développé ce type de biosenseur dans la levure et nous avons observé qu'il est très performant pour visualiser la traduction dans les cellules vivantes (Figure 1). L'objectif de la thèse sera de l'implémenter dans des cellules humaines et de l'utiliser pour visualiser la traduction dans des neurones, normaux ou ayant des mutations entrainant la pathologie du X fragile (FXS). En effet, cette pathologie est lié à la sous-expression de la protéine FMR1, qui régule la traduction de nombreux ARNm dans les neurones, dans le soma ou les dendrites. Ce biosenseur permettra de caractériser facilement et rapidement la régulation traductionnelle dans les cellules vivantes, supprimant ainsi un goulot d'étranglement persistant pour l'étude de la régulation de l'expression des gènes, et permettant de mieux comprendre la maladie FXS.

Les objectifs spécifiques de la thèse sont les suivants:
1-Développement du biosenseur traductionnel dans les cellules humaines.
2-Utilisation du biosenseur traductionnel dans les neurones pour comprendre le FXS.
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Translation is a fundamental step in gene expression. It carries a large part of the cell's regulations, whether in a gene-specific or a global manner. To study it, we now have powerful biochemical methods such as Ribo-Seq. We also have microscopy methods that can image translation of single mRNAs, which were recently developed by several teams including ours. These methods have profoundly impacted the field, but it remains a challenge to image translation globally at the level of the entire transcriptome. This is however very important as translation is strictly regulated at the transcriptome level by key pathways such as mTOR, which regulates cell growth in function of nutrients availability. By imaging translation globally in living cells, it will become possible to tell when and where translation occurs, and thus to access key information that were previously out of reach, such as: (i) cell-to-cell variation of translation; (ii) temporal regulation of translation at the single cell level; (iii) intracellular compartments where translation occurs. The objective of the PhD is to develop a novel method that will enable to image translation globally at the level of the entire transcriptome, in real-time and living cells. This will be a breakthrough achievement and we expect that it will profoundly impact the gene expression field. To do so, the PhD candidate will develop a fluorescent biosensor that lights up upon joining of ribosomal subunit, when translation initiates, and that turns off when ribosomal subunits separate after translation terminates. Our team has developed this type of biosensor in yeast and we have observed that it is very effective in visualizing translation in living cells (Figure 1). For the PhD thesis, the biosensor will be implemented in human cells and used to visualize translation in neurons, wild-type or carrying mutations causing the fragile X pathology (FXS). Indeed, this pathology is linked to the under-expression of the FMR1 protein, which regulates the translation of a large number of mRNAs in neurons. This biosensor will allow to easily and rapidly characterize global and compartment-specific translational regulation in living cells, thereby removing a persistent and important bottleneck in the gene expression field and to better understand the FXS pathology.

The specific aims are the following:
1-Biosensor development in human cells. The first goal will be to test different versions of the biosensor to optimize its sensitivity. This will be done by constructing HEK cell lines stably expressing the biosensor by CRISPR knock-in. The second goal will be to measure the variability of translation from one cell to another, the variations of translation along the cell cycle, as well as to identify the compartments where translation takes place .
2-Use of the translational biosensor in neurons to understand FXS. The localization of mRNA in specific sub-cellular compartments plays important roles in the cell (2, 3, 4). In neurons, local translation of some mRNAs in dendrites and axons has been found to play essential roles in neuronal functions. Indeed, several neurological diseases of genetic origin are caused by an altered local translation at the synapses, as in the cases of the Fragile X Syndrome (FXS). Thus, ES cells will be modified by CRISPR knock-in to introduce the biosensor, and then differentiated in neurons to measure translation dynamics at synapses, before and after synapse activation, and to compare wild-type to FXS mutant neurons. This will help to understand how local translation contribute to neuronal functions, and how an alteration in this process leads to FXS disease.
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Début de la thèse : 01/10/

Funding category

Public funding alone (i.e. government, region, European, international organization research grant)

Funding further details

Concours pour un contrat doctoral